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苦荞(Fagopyrum tataricum)是蓼科荞麦属的一种兼具药用和保健功能的小杂粮,富含以芦丁、花青素以及原花青素为代表的黄酮类物质。黄酮含量是其主要质量性状,阐明黄酮生物合成调控机理是苦荞分子育种的理论基础。植物黄酮的生物合成主要由关键酶和转录因子来调控,现有研究表明转录因子能同时调控黄酮代谢途径中多个关键酶基因的表达,具有比单个关键酶基因更广泛和明显的调控作用。其中,MYB转录因子种类繁多,作用机制复杂,是参与植物黄酮代谢调控最重要的转录因子家族。本研究以高黄酮苦荞品种“西荞二号”为材料,基于其花期转录组数据,克隆其R2R3-MYB转录因子基因,通过生物信息学筛选黄酮合成相关的FtMYBs转录因子序列,采用酵母单杂交技术鉴定其转录激活活性,进一步采用转基因技术分析它们对拟南芥黄酮合成途径相关基因表达和代谢产物积累的影响。本研究不仅丰富了苦荞MYB转录因子家族数据,加深了对苦荞黄酮合成调控机制的理解。主要结果如下:1.采用RT-PCR和PCR技术,克隆获得24个苦荞R2R3-MYB转录因子的cDNA和DNA序列。序列分析表明,它们都编码典型的R2R3-MYB转录因子。cDNA序列与DNA序列对比分析表明,有11条基因含有2个内含子,5条基因含有1个内含子,且都符合GT-AG剪切规则,其余8条基因没有内含子。系统进化树分析表明,有12条FtMYBs转录因子可能参与苦荞逆境胁迫应答,7条可能参与黄酮代谢,2条可能参与了木质素合成通路或者逆境胁迫应答,2条可能参与了细胞的命运决定,1条功能尚不确定。2.构建了FtMYB15、FtMYB16 FtMYB23和F M 等 4 个黄酮相关 FtMYBs基因的酵母单杂交载体,并转入酵母AH109细胞中,通过营养缺陷平板进行筛选和活性鉴定。β-半乳糖苷酶滤纸显色结果表明,仅有FtMYB23具有明显的转录激活活性,而FtMYB15、FtMYB16和FtMYB24不具有或具有不明显的单独转录激活活性。3.构建了FtMYB15、FtMYB16、FtMYB23 和FtMYB24 等 4 个黄酮相关 FtMYBs基因的pCAMBIA1301植物表达载体,通过农杆菌感受态细胞GV3101的介导,采用浸花法将其转化花期拟南芥。通过抗性平板筛选以及PCR鉴定,最终获得过表达的T3代纯合阳性植株。FtMYB15转基因拟南芥植株叶片呈现不同程度的红色和种皮颜色加深等表型变化,花青素和原花青素含量显著高于野生型(P<0.01),其合成相关酶基因AtANS、AtDFR、AtBAN和AtTT12等的表达量均极显著增加(P<0.01),而黄酮醇支路关键酶基因AtFLS表达量显著下降(P<0.05);FtMYB16转基因拟南芥植株叶片出现红色色素的积累的表型变化,花青素含量显著高于野生型(P<0.05),其合成相关酶基因AtCHS、AtF3’H、AtANS和AtDFR等的表达量显著提高(P<0.01),而黄酮醇支路关键酶基因AtFLS无显著变化(P>0.05);FtYB23转基因拟南芥表型无明显变化,但是其原花青素含量显著高于野生型(P><0.05)。其合成相关酶基因AtCHS、AtDFR和AtBAN等极显著提高(P<0.01),黄酮醇支路关键酶基因AtFLS表达量也极显著提高(P<0.01),而花青素支路关键酶AtANS表达量却被显著抑制(P<0.01);FtMB24转基因拟南芥植株中叶片出现不同程度的红色色素积累,花青素含量显著高于野生型(P<0.01),其合成相关酶基因AtCHI、AtF3’H、AtANS和AtDFR表达量极显著提高(P><0.01),黄酮醇支路关键酶基因AtFLS表达量也显著提高(P<0.05)。综上表明,FtMYB15可同时参与植物花青素和原花青素合成的调控,FtMYB16和FtMYB24均可参与植物花青素合成的调控,而FtMYB23可参与植物原花青素合成的调控。