前言白介素-7（Interleukin-7,IL-7）是一种能诱发造血细胞和恶性肿瘤发生和增殖的细胞因子,在乳腺癌细胞系IL-7通过磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol3-kinase,PI3K）敏感径路诱发乳腺癌细胞的生长,这对研究乳腺癌的发生和发展有着重要意义。卵巢癌可刺激宿主免疫细胞分泌IL-7,血清和腹腔液IL-7升高是宿主免疫系统抗肿瘤作用的一种表现。IL-7作为一种具有潜在抗肿瘤作用的免疫调节活性因子,其在腹水中水平升高不及血清显著,推测腹腔局部可能存在某些免疫抑制因素。提高腹腔局部IL-7水平可对卵巢癌有治疗意义。目前IL-7在肿瘤中的作用不一,作用机制也不清楚。目的本研究探讨IL-7在肺癌中的表达,分析它们与各临床病理因素之间的关系,揭示IL-7在肺癌细胞侵袭和转移过程中的作用机制。实验材料和方法一、材料100例原发性非小细胞肺癌癌组织及癌旁正常肺组织标本均来自1980年到2005年在中国医科大学附属一院实行手术的病人,患者术前均未接受放化疗。标本用中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4μm切片,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（streptavidin-peroxidase,S-P法）检测组织中IL-7、IL-7R和血管内皮生长因子-D（vascular endothelial growth factor-D,VEGF-D）蛋白表达情况,微血管密度（microvessel density,MVD）和淋巴管密度（lymphaticvessel density,LVD）。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定:IL-7、IL-7R和VEGF-D以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。光镜下每张切片选取癌细胞较多的10个高倍视野计数100个癌细胞中的阳性细胞数,IL-7、IL-7R（Interleukin-7Receptor）和VEGF-D的评估为:无阳性细胞为“-”,阳性细胞数≤5%为“+”,阳性细胞数为5%-20%为“++”,＞20%为“+++”,其中“++”和“+++”为高表达,“-”和“+”为低表达。血管和淋巴管判定标准为:内皮细胞形成条状、裂隙状等孤立结构棕黄染色或有管腔者按一条血管或淋巴管计数。低倍光镜下确定3个微血管或淋巴管高密度区域（热点）,然后在高倍镜下分别计数每个热点中3个区域的CD34染色（用于标记MVD）和D2-40（用于标记LVD）染色阳性管腔数均值。MVD=（CD34阳性管腔数-D2-40阳性管腔数）均值;LVD=D2-40阳性管腔数均值。当计数相差10%以上时则重新计数。二、细胞培养分别用含10%新鲜胎牛血清的RPMI1640或DMEM培养基,在37℃、5%CO₂的条件下培养人肺巨细胞癌细胞系PG-LH7和NCI-H460、人肺腺癌细胞系A549和SPC-A1和人肺鳞癌细胞系SK-MES-1。三、逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）提取细胞总RNA,按RT-PCR（TaKaRa）试剂盒方法进行逆转录反应,反应体系为20βL,取4βL的RT产物进行PCR反应,反应体系为20μL。PCR引物经在GeneBank上比对后在bio-spring公司合成。PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行检测,采用凝胶成像分析系统进行半定量分析。四、Western Blot法在收集的细胞内加入裂解液充分裂解,低温高速离心（4℃,12000转/min,30min）,提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60ug。电泳（12%SDS-PAGE凝胶）、转印（50V,120min）、5%正常小牛血清封闭,一抗c-Jun（1:200）、phosphorylated-c-Jun（p-c-Jun,1:200）、c-Fos（1:200）、VEGF（1:200）、VEGF-D（1:200）和β-actin（1:200）,抗体均购自Santa Cruz,USA,4℃孵育过夜,分别与各自对应的二抗（1:2500,chemicon,USA）室温孵育2h,3,3’-二氨基联苯胺（DAB）显色,结果经自动电泳凝胶成像分析仪（Chemi Imager 5500,Alpha Innotech,USA）采集,进行灰度值测定。五、染色质免疫沉淀法加入37%的甲醛使A549细胞内的蛋白和DNA充分交联,裂解细胞,超声剪切DNA片段（80w,30次）,免疫沉淀交联的蛋白和DNA,洗脱蛋白/DNA复合物,逆转蛋白/DNA复合物交联,纯化DNA,做PCR,重复三次,取平均值。六、免疫共沉淀法在收集的新鲜培养的细胞中加入裂解液,充分裂解后,每管分别加入100ul磁珠（Miltenyi Biotec,Germany）和20ul c-Jun抗体,使终体积为1ml,4℃孵育30min,用蛋白裂解液冲洗u柱（Miltenyi Biotec,Germany）,将蛋白样加入u柱,加入20ul的95℃预热上样缓冲液,孵育5min,用50ul的95℃预热上样缓冲液冲洗,收集液体,做Western blot,重复三次,取平均值。七、细胞迁移和侵袭能力检测在transwell小室（Corning公司）下室加入600ul含10%小牛血清DMEM培养基,上室中加入100ul无血清DMEM培养基,接种A549细胞数为2.5×10⁴个。37℃、5%CO₂孵箱中培养6hr后吸尽培养基,PBS清洗后,甲醇室温固定15min,用棉签轻擦掉微孔膜上表面的细胞,苏木素染色,室温干燥过夜。取下微孔膜,置载玻片上,镜下观察。细胞侵袭能力的测定用预冷的无血清培养基以1:7稀释Matrigel（BD Biosciences,USA）加入上室100ul,在室温下放置6h。使用前用培养基重新水化并吸净,其他与迁移实验相同,培养18hr后观察结果。八、MTT法检测细胞增殖将单个细胞悬液接种于96孔培养板中,每孔含10³个细胞,培养24h,每孔加入MTT（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide）溶液继续培养4h,加入DMSO,490nm波长下测定各孔光吸收值,以不含细胞的等体积培养基作对照。绘制细胞生长曲线。九、体内裸鼠移植实验将24只4周龄裸鼠背部皮下注射A549细胞（2×10⁷个/只）,1周后（有肿瘤形成）随机分成4组,每组6只。以后每周1次,每次50ul背部皮下注射。一组:注射PBS;二组注射IL-7（20mg/ml）;三组注射IL-7（20mg/ml）+IL-7R（50mg/ml）;四组注射IL-7R（50mg/ml）。10周后处死。观察瘤大小,并取瘤组织检测其他指标。十、数据分析使用SPSS13.0统计软件进行数据处理,以P＜0.05为有统计学意义。实验结果1、IL-7/IL-7R与各临床病理因素、VEGF-D表达、淋巴管密度、淋巴结转移和患者预后的关系免疫组化分析100例肺癌组织,其中IL-7蛋白高表达为61例（61%）,低表达者为39例（39%）;IL-7R蛋白高表达为62例（62%）,低表达者为38例（38%）;VEGF-D蛋白高表达为59例（59%）,低表达者为41例（41%）。IL-7和IL-7R的表达分别与各临床病理因素的关系:IL-7的表达水平与肺癌的分期呈正相关（P=0.001）,与淋巴结转移呈正相关（P＜0.001）;IL-7R的表达水平与肺癌的分期呈正相关（P=0.007）,与淋巴结转移呈正相关（P＜0.001）。IL-7和IL-7R的表达水平与性别、年龄,组织分型,分化程度都不相关。IL-7和IL-7R的表达分别与VEGF-D表达水平的关系:IL-7的表达水平与VEGF-D表达水平呈正相关（P＜0.001）;IL-7R的表达水平与VEGF-D表达水平呈正相关（P=0.002）。IL-7、IL-7R和VEGF-D的表达与MVD和LVD的关系:IL-7高表达组的LVD（21.39±12.39）明显高于低表达组的LVD（11.10±9.48）,差异显著（P=0.003）;IL-7R高表达组的LVD（21.39±12.39）明显高于低表达组的LVD（11.10±9.48）,差异显著（P=0.041）;VEGF-D高表达组的LVD（21.39±12.39）明显高于低表达组的LVD（11.10±9.48）,差异显著（P＜0.001）。IL-7、IL-7R和VEGF-D的表达与MVD不相关。IL-7、IL-7R和VEGF-D的表达与患者预后的关系:IL-7高表达组的生存时间（21.39±12.39）明显低于低表达组的生存时间（11.10±9.48）,差异显著（P=0.008）;IL-7R高表达组的生存时间（21.39±12.39）明显低于低表达组的生存时间（11.10±9.48）,差异显著（P=0.031）;VEGF-D高表达组的生存时间（21.39±12.39）明显低于低表达组的生存时间（11.10±9.48）,差异显著（P=0.022）。2、IL-7/IL-7R促进肺癌细胞中VEGF-D的表达外源性人重组IL-7作用于肺癌IL-7R⁺细胞A549、SPC-A1、LH7和SK-MES-1后,VEGF-D的表达升高,VEGF-C的表达无明显变化;用抗IL-7R抗体作用于这些细胞后VEGF-D的表达降低。而无论是外源性人重组IL-7还是抗IL-7R抗体均对IL-7R^-细胞H460无影响。3、IL-7/IL-7R通过c-Fos/c-Jun通路促进VEGF-D的表达IL-7能促进c-Fos、c-Jun和p-c-Jun的表达;而阻断IL-7R能抑制c-Fos、c-Jun和p-c-Jun的表达。用AP-1特异性抑制剂SP600125作用后,VEGF-D的表达下降。说明IL-7/IL-7R通过c-Fos/c-Jun通路调控VEGF-D的表达。4、IL-7/IL-7R促进c-Fos/c-Jun异二聚体形成,并促进该二聚体与VEGF-D的DNA结合免疫共沉淀结果显示,IL-7能促进c-Fos/c-Jun异二聚体形成增多;而阻断IL-7R能抑制c-Fos/c-Jun形成异二聚体。染色质免疫沉淀结果显示,IL-7能促进c-Fos/c-Jun异二聚体与VEGF-D的DNA结合;而阻断IL-7R则抑制c-Fos/c-Jun异二聚体与VEGF-D的DNA结合。5、MTT结果显示IL-7能促进肿瘤细胞生长,而阻断IL-7R则抑制肿瘤细胞生长。6、在体内裸鼠抑制实验结果显示IL-7通过IL-7R调控AP-1复合物中c-fos,c-Jun表达及磷酸化,促进c-fos和c-Jun形成异二聚体,并与VEGF-D基因结合,调控VEGF-D基因转录,促进VEGF-D表达,从而促进肿瘤淋巴管形成及转移。结论1、IL-7/IL-7R高表达与非小细胞肺癌的分期、淋巴结转移和预后不良正相关,与VEGF-D的表达正相关,IL-7/IL-7R和VEGF-D高表达组肿瘤中的LVD明显高于低表达组。2、在肺癌IL-7R⁺细胞中IL-7通过IL-7R调控AP-1复合物中c-fos,c-Jun表达及磷酸化,促进c-fos和c-Jun形成异二聚体,并与VEGF-D基因结合,调控VEGF-D基因转录,促进VEGF-D表达。而IL-7对VEGF-C无调控作用。3、在体内实验中IL-7也通过该机制促进VEGF-D表达,从而促进肿瘤淋巴管形成及转移。