黄酮类化合物是一种重要的药用成分,不仅在植物生长发育过程中参与紫外线防护、花色形成等过程,还具有抗肿瘤、抗癌等作用。而查尔酮异构酶(CHI)和查尔酮合成酶(CHS)是黄酮类化合物合成途径中的两个限速酶,二者的表达与否对体内黄酮物质的合成具有关键的调控作用,因此,克隆出两种酶基因,对其进行功能分析,并利用基因工程技术调控黄酮物质的合成,对提高黄酮含量、增加药用价值或改变花色、提高花卉欣赏价值具有重要的意义,同时也可为植物黄酮类化合物合成途径的遗传调控研究奠定基础。CHI与CHS广泛存在于植物中,并已从多种植物中分离出这两个酶基因。然而,绿豆作为一种富含黄酮物质的重要经济作物,还未克隆出这两个酶基因,因此,本研究以此为着手点,克隆出绿豆CHI与CHS基因,并将CHI基因转化烟草和大豆,对其功能进行初步探究,具体研究结果如下：1、根据其它高等植物CHI cDNA序列保守结构域设计4条引物,结合RT-PCR,以绿豆叶片cDNA为模板,采用分段克隆的方法克隆出绿豆CHI基因片段,然后拼接成为具有完整ORF的序列。最后设计特异引物进行验证,最终获得完整ORF为669 bp的绿豆CHIcDNA全长序列,编码222个氨基酸,经BLAST比对,发现其在氨基酸水平上与大豆、紫花苜蓿的CHI基因同源性达到80%以上,且序列中包含查尔酮超家族以及PLN02559和查尔酮等保守结构域。2、采用同源克隆的方法,克隆得到绿豆CHS基因,并利用特异引物及巢式PCR进行验证。最终获得绿豆CHS基因家族中的3条全长cDNA序列,均为1170 bp,编码389个氨基酸,以及1段713 bp通读的cDNA片段。三条全长序列之间核苷酸相似性达到90%以上,均包含CHS-like结构域,经过BLAST分析,发现其在核苷酸水平上与菜豆、豇豆等同源性均在89%以上。3、构建重组表达载体pFGC5941-CHI,并通过PCR、酶切及测序进行验证,表明重组载体构建成功。4、利用农杆菌介导法将pFGC5941-CHI重组载体导入烟草和大豆,经过PCR检测,共获得13株烟草阳性植株,以及10株大豆阳性植株。5、通过RT-PCR及涂抹除草剂实验,证明载体上的BAR基因片段已转入烟草和大豆中,并得到表达。涂抹除草剂实验中发现转基因植株在涂抹除草剂的一周后仍然正常生长,而非转基因植株在涂抹除草剂的一周后枯焦死亡。此外,以CHI基因特异引物对转基因烟草及大豆进行RT-PCR进行检测,结果表明绿豆CHI基因在部分转基因植株中得到表达。6、提取并检测转基因烟草和大豆总黄酮含量,与对照相比均得到显著提高,转基因烟草和大豆的总黄酮含量分别最高为对照的3.3和2.3倍,说明转入的CHI基因表达对其体内的黄酮物质合成调控起到了促进作用。