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戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus,HEV）引起的病毒性肝炎。HEV为无包膜、单链、正义 RNA病毒，其基因组全长约7.2kb,包含三个阅读框，即 ORF1-ORF3。明确感染人的HEV可分为1-4基因型，其中3和4型既感染人也感染动物，为人畜共患性的，猪是其主要动物宿主。研究显示，ORF3蛋白是一个多功能蛋白，参与多种机制，但 ORF3的功能至今还不明确。为了探索 HEV感染、致病及不同宿主差异的机制，我们采用酵母双杂交的方法筛选了与4型 ORF3相互作用的猪宿主蛋白，对这些蛋白的相互作用进行验证，并采用生物信息学软件和技术对ORF3蛋白的功能及其对宿主细胞生物过程产生的影响进行了分析和推测，同时也比较了人和猪宿主差异的机制。我们完成了如下工作： 1、首先对本实验室构建的pGBKT7-W3-ORF3诱饵质粒进行了鉴定，然后将质粒转化 Y2H gold酵母菌中，进行诱饵蛋白毒性、自激活检测，并应用Western Blot检测 ORF3蛋白在酵母菌株 Y2Hgold中的表达情况，确认 ORF3蛋白没有毒性、没有自激活性及在 Y2Hgold中正确表达。 2、采用大规模酵母质粒转化技术，将猪肝 cDNA文库质粒转化酵母细胞 Y2H/pGBKT7-W3-ORF3,进行猪肝 cDNA文库筛选，共进行了三次文库筛选，筛选了1.09×107个cDNA文库克隆，获得了257个阳性克隆。 3、257个阳性克隆经酵母质粒提取，大肠杆菌质粒扩增，质粒测序、自激活及与 ORF3共转再确认，最终得到54个真阳性克隆。这54个克隆中，有50个是已知蛋白，4个是未知蛋白。 4、将筛出的54个蛋白中的51个蛋白核酸序列分别构建至 pProlabel载体，与pAcGFP-W3-ORF3共转293FT细胞，采用Chemiluminescent Co-IP方法对蛋白相互作用进行验证，最终我们获得38个相互作用蛋白。对这些蛋白进行生物信息学分析，发现这些蛋白分布在细胞的多个部位，参与细胞代谢、细胞免疫、刺激反应、转运等多个生物过程。推测 ORF3可能通过这些蛋白发挥多重作用。通过对蛋白功能富集聚类分析，发现有显著多数量的蛋白分别参与甘氨酸丝氨酸苏氨酸代谢、血小板激活和脱颗粒、补体和凝血级联、不饱和脂肪的合成、血液凝固、高尔基体相关运输的生物合成等生物过程。ORF3可能通过与目标宿主蛋白相互作用，参与这些相应的生物过程。 5、采用经典的Co-IP方法对ORF3与 PLG、SERPINF2的相互作用进行了验证，免疫印迹结果显示它们存在相互作用。PLG和SERPINF2是纤溶系统蛋白，结合HEV感染宿主的表现，ORF3可能与 HEV的致病性有关。 综上所述，我们首次采用酵母双杂交的方法筛选了与 ORF3蛋白相互作用的猪肝蛋白，使用化学发光免疫共沉淀进行了验证，对结果进行了分析和预测。这些发现为我们进一步研究 ORF3蛋白的功能提供了线索和方向。