大蒜脂溶性硫化物通过H2S介导调控脱氢酶活性机制的研究

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近年来,H2S作为第三种气体信号分子出现,被认为是与NO和CO类似的重要的细胞信号传导分子。研究表明,H2S介导了与炎症相关的某些生理生化过程。最新的文献报道了一些大蒜硫化物在活性巯基物质的诱导下具备释放H2S的潜能,如二烯丙基三硫化物(DATS)和二烯丙基二硫化物(DADS)。因此,H2S的作用机制还值得在有机硫化物体系进一步探索;同时,蛋白酶类具备催化活性,可以实时反映H2S与蛋白的作用过程;文中对多种硫化物(包括大蒜有机硫)溶液中总H2S的储备能力进行了评价。结合活性酶体系,在H2S机制下重新审视大蒜有机硫,以期揭示大蒜硫化物在生理活性方面新的生物学意义。实验结果如下:(1)比较并评价不同硫化物溶液中总H2S的储备能力。首先,建立比色法检测溶液中的H2S;其次,无机硫化物(Na2S/NaHS/K2Sx)在水溶液中就可以直接检测出H2S;大蒜有机硫化物DATS/DADS/大蒜素,不能直接检测出H2S,只有在活性巯基类物质GSH/DTT/ASH存在的条件下,才可以检测出H2S,而二烯丙基一硫化物(DAS)则不是H2S的储备物;最后,文中对所有硫化物中总H2S的储备能力做出评价。其中对大蒜素中H2S储备能力的揭示尚未见报道。(2)探索硫化物对酶蛋白的作用机制。首先,利用荧光光谱法实时监测乙醇脱氢酶(ADH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)的活性,Na2S、NaHS、K2Sx,DATS、DADS、大蒜素(与活性巯基类物质作用后)对酶蛋白的活性均有抑制作用;其次,利用巯基氧化剂(H2O2)、巯基衍生剂(NEM)和巯基保护剂(DTT),推测Na2S、NaHS、K2Sx、DATS、DADS、大蒜素对酶蛋白的作用可能发生在巯基上;进而推测DATS、DADS、大蒜素的作用机制与Na2S、NaHS、K2Sx类似。(3)探索硫化物对酶蛋白作用机制的具体位点。利用圆二色谱(CD)探索酶蛋白二级结构的变化,经Na2S/DADS/DATS/大蒜素处理,酶蛋白的二级结构会发生显著改变,表明H2S处理可能会使酶蛋白的二级结构发生修饰作用;利用MALDI-TOF-MS/MS探索蛋白一级结构并揭示机理,DATS/DADS/大蒜素与Na2S/NaHS/K2Sx具有类似的调控蛋白的机制,通过与酶蛋白中部分半胱氨酸位点以硫烷化作用的方式,产生衍生化protein-SSH调控了蛋白活性。结果表明,大蒜脂溶性硫化物DATS/DADS/大蒜素是天然的H2S储备物,具备可调控的释放H2S的特性,更加安全可靠,可以作为Na2S/NaHS/K2Sx的天然替代品;本文揭示的DATS/DADS/大蒜素具备硫烷化衍生蛋白质巯基的调控机制,应该是大蒜有机硫生理活性的生物学基础,更正了大蒜硫化物的生物活性是来源于抗氧化性的错误认知。
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