目的:　　近年来，由于NICU救治水平的整体提高，表面活性物质替代治疗的广泛应用以及呼吸机管理技术的日益完善，早产儿的存活率有了明显提高。早产儿治疗过程中，往往需要长时间吸入高浓度氧，甚至呼吸机辅助治疗，由此所引起的支气管肺发育不良(Bronchopulmonary dysplasia，BPD)就成为了威胁着早产儿健康和生命的主要疾病之一。这种由过度机械通气和氧中毒引起的BPD以肺损伤和肺纤维化为特征，其机制可能涉及活性氧、细胞因子、生长因子、MMPs以及细胞信号传导等。虽然对此的研究从未中断过，但令人感到遗憾的是，目前仍缺乏有效的方法逆转和减缓这一疾病的进程。大约10～15％的患儿会因严重的肺间质纤维化于生后1年内死于呼吸衰竭，存活者也因肺功能障碍需长期的依赖氧气甚至机械通气治疗。虽然BPD的发病机制目前尚未完全清楚，但其肺间质纤维化的晚期病理结局已无可置疑，肺间质纤维化主要表现为过度增殖的肺成纤维细胞（lung fibrolasts，LFs）沉积于肺间质或替代正常的肺上皮。一旦BPD进入肺间质纤维化阶段，损伤即为不可逆的。组织损伤后纤维组织的增生替代是组织修复的一种重要的病理生理过程，因此，如何适时而又适度的调控LFs的增殖，使之既不影响组织的修复，又不因增生过度而纤维化，就成为防治纤维化的关键。而这一问题的解决，则必须从LFs增殖的细胞周期调控机制着手。　　细胞周期是由细胞周期素(cylin)、细胞周期素依赖蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)以及细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白(cyclin-dependent kinases inhibitors，CDKIs)进行调节。其中P16、Rb和E2F1蛋白在CDK-CDKI的网络调控系统中起重要作用。在细胞周期的调控机制中存在着一条P16-CyclinD1-CDK4/6-Rb-E2F1蛋白信号传导通路。在正常细胞的分化增生过程中，CyclinD1与CDK4/6形成复合物，使Rb蛋白磷酸化（即Rb蛋白失活），Rb蛋白失去抑制转录因子E2F1启动DNA合成的功能，细胞由G1期进入到S期，细胞增殖。P16蛋白是一种CDK4的抑制因子，能够和CyclinD1蛋白竞争性结合CDK4，阻止它们与相应的周期素结合，抑制其蛋白激酶活性，并能够抑制CDK4介导的Rb蛋白磷酸化，当去磷酸化Rb与E2F1结合形成复合物时，可抑制E2F1的转录活化，从而阻止细胞由G1期进入S期，抑制细胞增。P16、Rb、CyclinD1和CDK共同构成了一个反馈调节环路，调节细胞的生长周期。一旦P16基因发生变异，上述环路即无法进行下去。因此，P16-CyclinD1-CDK4/6-Rb-E2F1蛋白信号传导通路在细胞增殖进程中发挥关键的作用，在多种增生性疾病的发生发展过程中，存在该蛋白信号传导通路的调节异常。　　在我们的前期研究中已发现暴露于高氧中的早产鼠，其肺组织P16基因的表达水平明显低于空气对照组，原因在于高氧通过诱导肺成纤维细胞P16基因启动子异常甲基化，使得P16基因的表达水平降低。我们因此推测“高氧→P16基因启动子异常甲基化→P16基因表达水平降低→Rb蛋白磷酸化（PRb灭活）→转录因子E2F1解离→LFs生长失控→肺间质纤维化”。为了论证这一猜想，我们在以往研究的基础上，以高氧致BPD新生鼠肺组织原代分离培养的肺成纤维细胞为研究对象，研究P16-Rb-E2F1蛋白信号传导通路在BPD肺纤维化发生发展中的作用。此外，我们以特异的DNA甲基化抑制剂5-aza-CdR对高氧21天鼠原代培养的LFs进行处理，观察其对细胞增殖状态及P16、Rb和E2F1蛋白表达的影响:对BPD肺纤维化新生鼠予以5-aza-CdR治疗，观察鼠一般状态、生存率及肺纤维化程度的变化，试图为阐明BPD肺纤维化的发生机制提供新线索，为临床防治BPD提供新的突破口。　　方法:　　1、足月新生的Wistar大鼠生后12小时内即分别持续吸入85％氧或空气，于3d、7d、14d及21d分别进行鼠的肺LFs原代培养。绘制细胞生长曲线、计算细胞分裂指数、FCM分析细胞周期、测量细胞上清液中TGF-β1、CTGF及胶原含量。　　2、应用免疫组化、Westernblot法分别检测肺成纤维细胞P16、Rb、E2F1蛋白表达;应用Real-time PCR法检测其mRNA的含量。　　3、以不同浓度5-aza-CdR（0.5，1，5umol/L）处理高氧21d鼠的肺LFs，MTT比色法检测细胞活力，FCM检测各期细胞所占的比例。Western blot法检测肺成纤维细胞P16、RB、E2F1蛋白表达，MSP检测P16基因甲基化状态。　　4、自高氧7d起给新生鼠腹腔注射5-aza-CdR或生理盐水，隔日一次直至生后21d。统计21d鼠的存活率，记录体质量，计算肺系数;HE染色分析肺纤维化程度;测定胶原含量和TGF-β1水平;MSP检测P16基因甲基化状态。　　结果:　　1、BPD鼠原代培养的LFs生物学性状。分离自高氧组的鼠LFs增殖速度较空气组明显增快;高氧7d组细胞分裂指数较对应的空气组升高，14d、21d组则明显升高;FCM结果表明，高氧7d组细胞处于G0/G1期比率较对应的空气组有所下降，而S期细胞比率增加。14d、21d这一趋势更加明显;细胞上清液中TGF-β1、CTGF及胶原含量在高氧3d组与空气组3d无统计学上的差异;高氧7d组较对应空气组升高，高氧14d、21d组则明显升高。　　2、各组LFs中P16、Rb、E2F1的蛋白及mRNA表达。高氧3d组与对应的空气组相比，P16及E2F1蛋白的表达无明显差异，高氧7d组P16蛋白的表达减少E2F1蛋白表达增加，14d和21d组差异更加明显。各组细胞Rb蛋白的表达无明显差异。P16、Rb、E2F1mRNA表达与蛋白表达变化趋势一致。　　3、5-aza-CdR对异常增殖LFs的抑制作用。在经过72小时5-aza-CdR的治疗后，细胞的增殖活力开始降低，5-aza-CdR的浓度越高，细胞增殖活力减低的越显著。FCM结果显示1μmol/L和5μmol/L浓度的5-aza-CdR使LFs明显阻滞于G1期，G0/G1期细胞所占的比例明显增加，而S期细胞所占比例明显减少，随浓度的增加量效关系显著，G2/M期细胞无明显改变。在经过不同浓度5-aza-CdR处理5天后，P16基因在0.5μmol/L和1μmol/L呈现部分甲基化;5μmol/L呈现完全去甲基化状态。5-aza-CdR处理后P16蛋白表达增强，E2F1蛋白表达减弱，1μmol/L及5μmmol/L组较对照组统计学差异明显。　　4、5-aza-CdR对BPD新生鼠的防治作用。5-aza-CdR明显改善新生鼠的生存状态，体质量增加，21天生存率由26.9％提高至50％;RAC、ST及肺纤维化评分提示肺纤维化明显减轻，肺组织胶原含量和BALF中TGF-β1明显减低。　　结论:　　1、原代培养的BPD鼠LFs在细胞增殖、胶原合成及TGF-β1和CTGF表达方面与BPD鼠的肺组织病理变化是一致的。我们认为BPD鼠的肺成纤维细胞原代培养是在细胞水平上研究BPD肺纤维化发病机制及治疗方法的有效手段。　　2、高氧通过减弱G1/S调控点的作用，使更多的LFs越过了G1/S控制点由G1期进入S期，进入分裂状态，细胞增殖速度加快。　　3、暴露于高氧中的新生鼠，其肺成纤维细胞的P16基因mRNA及蛋白的表达水平降低，使得Rb蛋白磷酸化和非磷酸化水平发生改变，导致E2F1mRNA及蛋白表达水平升高，最终引起LFs的过度增殖。　　4、5-aza-CdR能在细胞水平上逆转P16基因甲基化状态，增强P16基因表达，引发了P16-Rb-E2F1蛋白信号转导通路的改变，对过度增殖的肺成纤维细胞起到抑制作用。　　5、5-aza-CdR可明显改善BPD新生鼠的生存状态，提供其生存率，减轻其肺组织纤维化程度，有可能用于BPD的防治。