基于酶和纳米颗粒标记的荧光淬灭与电化学免疫分析

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发展简便和高灵敏度的分析方法是目前在免疫分析研究领域的一个重要方面。酶和纳米颗粒标记的生物分子由于其自身的特点和优势,在荧光淬灭与电化学免疫分析方面具有广泛的应用前景,对它们进行研究无疑可以进一步推动免疫分析的发展。在此背景下,本文开展了如下工作:   1.提出了一种新型、简便、灵敏的基于免疫复合物分离和纳米金荧光淬灭的分析方法。该法是基于典型的对人IgG “三文治夹心”的非竞争异相免疫分析,并利用了纳米金标记的抗体可以产生荧光淬灭的特性。首先将羊抗人IgG 吸附在微孔板上,接着人IgG 被羊抗人IgG 捕捉结合,再被纳米金标记的抗体夹心形成免疫复合物。然后加入氢氧化钠和柠檬酸三钠的混合溶液解离免疫复合物,将获得的含有纳米金标记抗体的溶液进行荧光淬灭分析。荧光素在517 nm处激发的荧光强度与人IgG的浓度成反对数线性关系,其检测范围是10~5000 ng/ml,检测下限达到4.7 ng/ml。同时通过可见紫外和电化学分析分别验证了纳米金标记的抗体在解离后是否团聚以及免疫复合物是否完全解离。该法的应用可以扩展至检测其他目标分子如DNA 链和其他抗原,而且在临床诊断上有着广阔的应用前景。   2.提出了一种以纳米金作为电化学标记物的免疫传感器。在此方法中,包被的抗体首先通过被动吸附而固定在碳糊电极的表面,接着定量结合抗原和纳米金标记的抗体形成免疫夹心复合物。为了检测结合在电极表面的纳米金的量,先以电化学氧化纳米金生成AuCl4-离子,然后采用吸附伏安法定量检测吸附在电极表面的AuCl4-离子。峰电流与抗原(人IgG)浓度在10~500 ng/ml 范围内成线性关系,其检测下限为4.0 ng/ml。   3.提出了一种基于生物催化金属沉积和阳极溶出伏安检测的电化学信号放大免疫分析法。抗体首先通过一层自组装膜固定在金电极上,通过免疫夹心反应使碱性磷酸脂酶也连接到电极上。碱性磷酸脂酶催化磷酸抗坏血酸脂水解成抗坏血酸,而抗坏血酸则将银离子还原沉积在蛋白质修饰的电极表面。然后通过电化学氧化溶出并用阳极溶出伏安法来检测沉积下来的银。峰电流与人IgG在5~1000ng/ml 范围内呈对数线性关系,检测下限为2.2 ng/ml。联合运用具有高催化活性的酶和灵敏的阳极溶出伏安法显著增加了免疫分析的灵敏度。   4.提出了一种基于生物催化金属沉积的纳米粒子产物继续催化沉积金属的电化学连续信号放大免疫分析法。首先把抗体包被在微孔板上,形成免疫夹心复合物之后,进行生物催化沉积纳米银和银增强的反应步骤。沉积下来的银溶解后通过阳极溶出伏安法来检测。对磷酸抗坏血酸脂(AA-p)和银离子(I)的浓度,生物催化沉积和银增强的时间进行了优化。人IgG的浓度和溶出峰电流成线性关系,其范围从0.1~10 ng/ml,检测下限达0.03 ng/ml。通过扫描电子显微镜(SEM)   对银增强前后的纳米粒子形态进行了表征。可见,联合运用具有高催化活性的酶和纳米粒子连续放大分析信号,使免疫分析方法的灵敏度显著增加,这在降低生物分析的检测下限方面不失为一种非常有潜力的方法策略。
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