【摘 要】
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目的:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,尤其在卫生资源相对较差的国家,其发生发展与HPV感染密切相关。HPV是一种没有包膜的环状DNA病毒,分为高危型和低危型,高危型HPV的持续感染是导致宫颈癌的主要原因,特别是HPV16和HPV18型。中国东北地区宫颈癌的发生率与HPV16感染具有较高的相关性。本实验通过分子克隆和细胞转染技术构建了含有东北地区HPV16全基因组序列的HPV16.HaCaT重组细胞模
【基金项目】
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辽宁省重点研发计划（2018225009）； 辽宁省教育厅服务地方项目（LFKW201710）；
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目的:宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤,尤其在卫生资源相对较差的国家,其发生发展与HPV感染密切相关。HPV是一种没有包膜的环状DNA病毒,分为高危型和低危型,高危型HPV的持续感染是导致宫颈癌的主要原因,特别是HPV16和HPV18型。中国东北地区宫颈癌的发生率与HPV16感染具有较高的相关性。本实验通过分子克隆和细胞转染技术构建了含有东北地区HPV16全基因组序列的HPV16.HaCaT重组细胞模型,为后续HPV16的致病机制研究及抗药物筛选奠定基础。研究方法:收集东北地区HPV16单一感染患者宫颈脱落细胞,提取DNA,将HPV16全基因组分成4个区段,设计4对特异性引物,对HPV16全基因组进行分段扩增,测序后进行序列拼接及核酸序列分析,克隆东北地区HPV16全基因组序列。通过酶切和自身环化获得环状的HPV16,利用细胞转染技术将环状的HPV16和带有G418抗性的PTK-neo质粒共转染至HaCaT细胞,通过有限倍比稀释法在96孔板内筛选单克隆细胞,扩大培养,构建含有东北地区HPV16全基因组的HPV16.HaCaT重组细胞模型。利用PCR和细胞免疫荧光法检测重组细胞内HPV16早期基因的表达情况。通过细胞计数和MTS绘制细胞生长曲线检测HPV16对HaCaT细胞生长特性的影响。Western blot检测重组细胞内JAK/STAT信号通路相关因子的表达水平。结果:我们通过分子克隆技术构建了中国东北地区来源的HPV16重组质粒的表达载体,获得东北地区HPV16全基因组序列并提交至Genbank（Gen Bank登录号:MW320358）。通过序列分析比对,本实验克隆的HPV16序列属于亚洲亚型。通过酶切和自身环化获得环状的HPV16,利用细胞转染技术将环状的HPV16转染至HaCaT细胞,获得含有东北地区HPV16全基因组序列的HPV16.HaCaT重组细胞模型。PCR结果显示HPV16早期基因E1^E4、E5、E6、E7 m RNA能够在重组细胞内稳定表达,细胞免疫荧光实验结果显示HPV16主要癌蛋白E7在重组细胞内有所表达,初步鉴定HPV16在重组细胞内能够正常转录。通过细胞计数和MTS绘制细胞生长曲线,结果表明体外感染HPV16使细胞生长速度加快。Western blot实验结果显示HPV16.HaCaT重组细胞内JAK/STAT信号通路受到抑制。结论:获得中国东北地区HPV16全基因组序列及含有HPV16全基因组的HPV16.HaCaT重组细胞模型,并初步证明该重组细胞可以作为体外细胞模型进行后续实验。
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