论文部分内容阅读
水稻（Oryza sativa L.）是世界最主要的粮食作物之一,杂交育种是提高水稻产量的有效方法。与传统的三系杂交法相比,使用环境敏感型核不育系的两系杂交法更有利于水稻杂种优势的利用。安农S-1是世界上第一个籼型水稻温敏核雄性不育系,控制其温敏不育性状的基因tms5已被成功克隆。近年来,CRISPR/Cas9基因组编辑技术因其特有的综合优势备受青睐,已成为目前主流的基因组编辑技术,并被广泛应用于作物改良研究中。本研究利用CRISPR/Cas9技术对水稻TMS5基因进行编辑,构建多个品种的工程温敏不育系,主要结果如下:1.从C10、H12B、GA114、M15、T110、W55、P14、NYZ1、NYZ2、NJZ、NGZ、NH2、YXZ、JNSM、NXRZ共15个品种的T0代转化苗中通过潮霉素抗性检测筛选出TMS5基因发生突变的温敏核雄性不育植株,分单株收种子,作为T1代。在C10、H12B、GA114、T110、W55和P14共6个品种的T1代群体中通过潮霉素抗性检测与PCR检测初步筛选出不含转基因成分（“Transgene-clean”）的突变植株,并通过低温处理分单株收种子。2.通过梯度温度处理初步探索M15、T110、P14三个品种的工程温敏核雄性不育突变体的不育起点温度。对花粉进行碘-碘化钾染色,观察其育性,结果显示这三个品种的不育起点温度均介于24℃-28℃之间。3.对C10、P14和W55三个品种的“Transgene-clean”工程温敏核雄性不育系T2代植株进行全基因组测序,分析结果显示,在18个潜在脱靶位点中未发现脱靶情况。4.以“Transgene-clean”工程温敏核雄性不育系T2代和T3代群体为材料研究其遗传特性。结果显示GA114-23和T110-9这两个株系的T2代群体中未发现新的基因型,即靶点突变稳定遗传到T2代;C10-1的T2代群体和W55-5的T3代群体中均出现了两个靶点间片段倒位的新基因型,原因未知;双等位突变体H12B-16和GA114-22的两个等位突变基因依照经典的孟德尔遗传规律遗传到T2代。5.对DNA水平上突变类型不同的NYZ1工程温敏核雄性不育突变体（T0代）同一时间的花粉育性进行观察,在观察范围内并未发现差异,可能因为所检测的突变类型均造成移码突变或大段氨基酸序列的缺失,导致无法表达出有功能的蛋白。根据上述结果,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建了15个品种的水稻工程温敏核雄性不育系,在其中6个品种的T1代中初步筛选出“Transgene-clean”温敏核雄性不育系,并对工程温敏核雄性不育系的基本特性进行检测。