端粒酶（Telomerase）是一种核糖核蛋白，它能利用自身的RNA组分作为模板，催化合成端粒重复序列（脊椎动物为5’—GGTTAG—3’）。研究表明端粒酶的表达与细胞永生化及肿瘤发生密切相关，因此对端粒酶活性的检测日益受到重视。目前应用最广的检测端粒酶活性的方法是Kim等的端粒重复扩增程序（Telomeric Repeat Amplification Protocol，TRAP）。该方法引入了PCR扩增步骤，使检测灵敏度大大增加。但由于PCR反应的反向引物是端粒重复的互补序列，可结合在端粒重复序列的任意部位，导致PCR产物长度发生变化（变长或变短），不能如实反映端粒酶的持续合成能力（进行性，processivity），这个缺陷限制了TRAP反应的实际应用效果。针对这个问题，一些研究者通过在反向引物CX的5’末端加入短的锚定序列的方法阻止PCR产物错误延长，但未解决PCR产物缩短的问题。利用重新设计的反向引物和特殊的反应体系，对TRAP方法进行了重大改进，解决了上述问题，实现了对端粒酶活性的准确测定。利用这个方法，对各种细胞系，肿瘤临床样品的端粒酶活性进行了测定。并对端粒酶的酶学性质进行了研究。端粒重复扩增程序（TRAP）的改进 重新设计TRAP反应引物P1和P2。其中P2引物包括两部分，分别为端粒序列结合部分和锚定部分，反向引物的重新设计是本实验的关键改进之一。改进反应体系，引物使用经过重新设计的P1和P2。在体系中只有dATP、dTTP、dGTP三种核苷酸，不含dCTP核苷酸。端粒酶延伸反应后进行接尾反应，反应体系中的Taq聚合酶以P2的锚定部分为模板，在端粒酶产物末端催化合成锚定的“尾”序列。此步反应也可与延伸反应同时进行。反应液90℃加热3min灭活端粒酶，在此期间加入dCTP。然后进行PCR扩增。利用人工合成的端粒酶产物作为模板进行TRAP反应，表明改进反应能正确进行PCR扩增，达到了设计目的。端粒重复扩增程序（TRAP）的条件优化 对改进的TRAP反应进行优化，确定PCR扩增条件：94℃30s，64℃45s，72℃1min，27～30个循环。确定反应的最适pH为8.3，最适Mg离子浓度为1.5mM。检测了方法的灵敏度，人工合成模板R5含量在0.002～0.2amol 中文摘要一之间呈线性关系。检测了 293细胞的端粒酶活性，来自 10个细胞的抽提物可检测到活性，且细胞数在30～1000之间呈线性关系。不同细胞系与肿鹰样品端粒醇活性测定 测定了40例肿瘤细胞的端粒酶活性，其中37例阳性，3例阴性，阳．性率·92．5％。人的心、肺、胃、肾等正常组织未见端粒酶活性，人体胎盘组织有端粒酶活性。肿瘤细胞系293、Hela细胞、SMMC、HepZ、MCF7均可见端粒酶活性。并初步总结了端粒酶活性与肿瘤样本病理指标间的关系。端粒酶活性和端粒酶催化亚基表达的相关性 通过RT—PCR检测hTERT基因的表达，肿瘤样品有特异扩增产物。发现肿瘤样品端粒酶活性与端粒酶催化亚基表达之间有一致性。但端粒酶活性大小与催化亚基表达强度之间没有正相关关系。说明除催化亚基决定端粒酶活性外，细胞中的其他因素对端粒酶活性也有较大影响。端粒酶酶学性质研究 利用改进的lLAP方法对端粒酶的酶学性质进行了研究，发现不同种类的脱氧核苔酸对端粒酶活性的影响不同，考察了端粒酶的底物专一性；证明人的端粒酶对端粒序列有一定的核酸酶活性。