黑米花色苷抗应激性肝、肾组织毒性作用及黑老虎果花色苷成分的研究

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花色苷是广泛分布于自然界中的多酚类色素,是植物呈现绚丽色彩的主要来源,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等药理活性。本论文分两部分从不同角度对黑米、黑老虎果中的花色苷成分进行研究。第一,首次研究了黑米花色苷提取物对溴酸钾(KBrO3)诱发的小鼠应激性肾组织毒性和拘束诱发的小鼠应激性肝组织毒性的影响。第二,首次对黑老虎果中的花色苷成分进行鉴定与含量测定,并且,研究了其主花色苷的pH、热稳定性及抗氧化活性。在第一部分实验中,利用UPLC/Q-TOF-MS对黑米花色苷提取物中的花色苷成分进行定性分析,采用HPLC法对提取物中的花色苷成分进行定量分析,并运用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法评价了黑米花色苷提取物的体外抗氧化能力。通过腹腔注射KBrO3诱导小鼠氧化应激性肾组织毒性,小鼠的血清肌酐(Cr)含量的测定采用HPLC法。小鼠的血清尿素氮(BUN)、肾组织丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶(XOD)和一氧化氮(NO)含量的测定采用比色法。并测定了黑米花色苷提取物给药后上述各指标的变化情况。通过拘束负荷诱发小鼠应激性肝组织毒性,小鼠的血清谷丙转氨酶(GPT)含量的测定采用赖氏法,肝组织谷胱甘肽(GSH)含量的测定采用分光光度法。并测定了黑米花色苷提取物给药后上述各指标的变化情况。结果,在黑米花色苷提取物中共检测到9种花色苷,鉴定了其中的8种分别是, cyanidin-3,5-diglucoside、cyanidin-3-gentiobioside、 cyanidin-3-glucoside、 cyanidin-3-sambubioside、cyanidin-3-rutinoside、peonidin-3-glucoside、cyanidin和peonidin,其总含量为41.69%(相当于cyanidin-3-glucoside)。DPPH和ABTS自由基清除实验结果表明,黑米花色苷提取物显示出与Vc相近的体外抗氧化活性。腹腔注射溴酸钾9h后可诱发小鼠严重的肾组织毒性:小鼠的血清Cr和BUN含量显著升高,肾组织XOD、MDA和NO含量显著升高。黑米花色苷提取物能够有效降低小鼠的血清Cr和BUN含量,同时可以降低肾组织XOD、MDA和NO含量,改善小鼠的肾组织毒性程度。拘束12h后,血清GPT含量显著升高,表明拘束负荷诱发了小鼠严重的肝组织毒性。黑米花色苷提取物能够有效降低肝毒性小鼠的血清GPT含量,并可降低肝组织过高的XOD、MDA和NO含量,恢复肝组织GSH含量,改善小鼠的肝组织毒性程度。结果表明,黑米花色苷提取物是通过清除体内的自由基,改善机体的氧化应激状态,对KBrO3诱导的氧化应激性肾毒性和拘束诱发的应激性肝毒性发挥保护作用的。在第二部分实验中,首先用1%HCl-甲醇对黑老虎果中的花色苷成分进行提取,通过UPLC/Q-TOF-MS对提取物中的各花色苷成分进行鉴定,运用HPLC对各花色苷成分的含量进行测定。然后,对其主花色苷成分进行分离,用于研究其pH、热稳定性以及抗氧化活性。pH和热稳定性的研究分别采用分光光度法和HPLC法。抗氧化活性的研究采用DPPH和ABTS自由基清除法。结果表明,黑老虎果中共存在4种花色苷分别是, delphinidin-3-xylosylrutinoside、 cyanidin-3-glucosylrutinoside、cyanidin-3-xylosylrutinoside和cyanidin-3-rutinoside。这4种花色苷的含量由高到低依次为, cyanidin-3-xylosylrutinoside (83.74%)>> delphinidin-3-xylosylrutinoside(7.30%)> cyanidin-3-glucosylrutinoside (5.03%)> cyanidin-3-rutinoside (3.91%)。pH稳定性实验结果表明,cyanidin-3-xylosylrutinoside在pH <4下稳定,保持其原有的结构及吸收特征。热稳定性研究结果表明,cyanidin-3-xylosylrutinoside较活泼,在室温条件下(25°C)都不稳定,在60、90°C下发生严重降解生成cyanidin-3-sambubioside、cyanidin-3-glucoside、cyanidin-3-rutinoside和cyanidin。体外抗氧化活性测定结果表明,cyanidin-3-xylosylrutinoside的DPPH和ABTS自由基清除活性要强于BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚)。
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