论文部分内容阅读
背景:视网膜变性是一类由于遗传和环境多因素诱发的致盲性眼病。随着感光细胞的凋亡，二级神经元由于感光细胞传入缺失会逐渐发生重塑反应，包括神经元的死亡，细胞的迁移和神经网络的重建。研究视网膜内层神经元的重塑反应对于认识视网膜变性的病理机制，寻求治疗的窗口期和可能的治疗策略具有重要意义。RCS大鼠由于Mertk基因突变使得视网膜色素上皮细胞吞噬功能障碍，从而导致了感光细胞继发性凋亡，是一种研究视网膜变性的良好动物模型。在视觉信息传导通路中，光信号经感光细胞首先传递到视网膜双极细胞，最后传递到神经节细胞。当感光细胞变性视网膜双极细胞是视网膜重塑过程中最早发生改变的二级神经元，因此揭示视网膜双极细胞的重塑反应对于深入了解视网膜变性过程具有重要意义。然而视网膜双极细胞重塑的的意义及其分子调控机制尚不清楚。研究发现MicroRNA既参与了视网膜变性过程，也参与了神经发育、突起重塑过程，但microRNA是否调控了视网膜变性过程中双极细胞的重塑尚未见报道。 假设:在RCS大鼠视网膜变性过程中，microRNA参与调控了视网膜变性过程中视杆双极细胞异常突起的重塑反应。 目标:研究在RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞异常突起的重塑反应及其功能，阐明这种重塑反应的分子调控机制。 本研究分为三个部分: 第一部分:RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞形成异常突起的重塑反应 1、通过免疫组化和电生理实验分别从形态和功能上来鉴定RCS大鼠动物模型，证实RCS大鼠在视网膜变性过程中逐渐发生了感光细胞的凋亡和电生理功能降低。 2、研究RCS大鼠在视网膜变性过程中视杆双极细胞轴突形态变化，发现RCS大鼠视杆双极细胞轴突的长度未发生明显变化。 3、研究RCS大鼠在视网膜变性过程中视杆双极细胞树突形态变化研究，发现RCS大鼠视杆双极细胞的树突先回退，再逐渐伸入外核层，形成异常突起，并且该异常突起与残存的感光细胞建立了突触联系，提示在RCS大鼠视网膜变性过程中，视杆双极细胞树突发生了异常突起的重塑反应，并且这种异常突起具有信息传递能力。 第二部分:RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞异常突起形成的调控通路; 1、通过microRNA芯片检测，研究RCS大鼠视网膜变性过程中microRNA表达谱变化，发现与同天龄正常大鼠视网膜相比，RCS大鼠视网膜中miR-125b-5p表达显著降低，提示miR-125b-5p可能参与了RCS大鼠视网膜变性过程。 2、通过生物信息学预测miR-125b-5p靶基因为BDNF，双荧光素酶报告基因实验进一步证实miR-125b-5p可靶向调控BDNF的表达。 3、通过原位杂交和免疫组化检测miR-125b-5p及其靶基因BDNF在RCS大鼠视网膜中的表达，发现RCS大鼠视杆双极细胞阳性表达miR-125b-5p和BDNF，提示miR-125b-5p可能通过靶基因BDNF调控了RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞的重塑反应。 第三部分:RCS大鼠视网膜变性过程中miR-125b-5p通过BDNF调控视杆双极细胞异常突起重塑的机制 1、研究过表达和下调miR-125b-5p后对RCS大鼠视杆双极细胞突起重塑的影响，发现过表达miR-125b-5p后显著降低了视杆双极细胞的异常突起的长度和数量，视网膜中BDNF的表达降低，同时ERG b波幅值显著降低;相反，下调miR-125b-5p后视杆双极细胞的异常突起的长度和数量增加，视网膜中BDNF的表达增强，同时ERG b波幅值显著提高。提示miR-125b-5p调控了RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞异常突起的形成。 2、研究视网膜下腔注射BDNF后对RCS大鼠视杆双极细胞突起重塑的影响，发现外源性增加BDNF后显著增加了视杆双极细胞的异常突起的长度和数量，同时ERGb波幅值显著增高。提示BDNF调控了RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞异常突起的形成。 3、研究BDNF的下游通路在RCS大鼠视网膜变性过程中的表达变化，发现RCS大鼠视杆双极细胞阳性表达TrkB和CREB，过表达miR-125b-5p后降低了TrkB和CREB的表达，外源性增加BDNF后提高了TrkB和CREB的表达。提示BDNF-TrkB-CREB通路可能调控了RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞异常突起的形成。 结论: 1、RCS大鼠视网膜变性过程中视杆双极细胞发生重塑反应，部分树突伸入外核层形成异常突起，与残存的感光细胞建立了突触联系。 2、RCS大鼠视网膜变性过程中，miR-125b-5p通过负向调控其靶基因BDNF，从而影响了TrkB-CREB通路，调控了视杆双极细胞的异常突起形成的重塑反应。 3、下调miR-125b-5p和外源性增加BDNF会使RCS大鼠视杆双极细胞异常突起增多，ERG b波反应增强。表明视杆双极细胞的异常突起与残存的感光细胞建立了具有传导视觉信息的突触联系，并由此增强内层神经元信息输入、挽救变性视网膜的功能。 4、外源性增加BDNF可能是一种延缓视网膜变性、改善视功能新的治疗策略。