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MnSOD是动物体内重要的抗氧化剂,能催化分解生物体氧化过程中产生的有毒物O2- ?为O2和H2O2,从而防治多种与之有关的疾病,具有抗氧化应激和抗癌的功能。肉仔鸡的生长发育快,体内代谢比较旺盛,代谢过程中产生的有毒O2- ?较多,尤其是在心脏等代谢旺盛的器官。MnSOD是肉仔鸡体内一种重要O2- ?清除剂,在肉仔鸡抗氧化应激体系中起关键作用,而锰作为MnSOD的组成部分,对MnSOD基因的表达调控发挥着重要作用。本研究采用体外法研究锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD基因的表达调控作用。研究分为三个部分:(1)雏鸡心肌细胞原代培养;(2)锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD活性的影响;(3)锰对肉仔鸡心肌细胞MnSOD mRNA表达的影响。1采用组织贴块法和酶消化法结合差速贴壁法培养肉仔鸡心肌细胞,并对培养的细胞进行免疫细胞化学染色以鉴定是否为心肌细胞。分别应用胰蛋白酶和胶原酶对心肌组织块进行消化,通过观察细胞成活率以判定哪种消化酶更适合心肌组织的消化,应用0.12%的胶原酶对心肌组织分别消化5min、10min、15min,确定较好的消化时间。利用MDM、DMEM/F12、DMEM三种培养基培养心肌细胞,筛选合适的培养基。结果表明:贴块法简便、易操作,但是心肌细胞收获周期长,纯度相对较低,酶消化法操作相对较复杂,但是细胞收获周期短,纯度较高,采用差速贴壁和添加Brdu的方法来抑制成纤维细胞的增殖,能较好的控制心肌细胞纯度;免疫细胞化学染色结果表明,培养的细胞为心肌细胞。胶原酶比胰蛋白酶更适合鸡心肌组织块的细胞分离消化;0.12%的Ⅰ型胶原酶37℃分次消化,每次消化10min能够较好的分离心肌细胞;MDM和DMEM/F12培养基比DMEM培养基更适合鸡心肌细胞的培养。2将经缺锰饲粮饲喂7d的肉仔鸡处死后用于鸡心肌细胞培养,将培养5~7d长成单层的心肌细胞分别加入含0.1、0.5、1.0、2mM/L无机硫酸锰的培养基溶液,同时设不加锰的对照组,每个处理3个重复,每个重复2细胞培养孔,在加入培养液后的6、12、24、48h时分别采集细胞。按照超氧化物歧化酶(SOD)分型测试盒提供的方法测定肉仔鸡心肌细胞MnSOD的活性。结果表明:添加0.1、0.5、1.0mM/L浓度锰的心肌细胞MnSOD活性与不加锰的心肌细胞MnSOD活性无显著差异,而添加2.0mM/L浓度锰的心肌细胞MnSOD活性要显著高于其他各组的MnSOD活性;添加锰后的6~24h里心肌细胞MnSOD活性变化不大,当培养至48h时心肌细胞MnSOD活性有明显升高。由此可知,用2.0mM/L无机硫酸锰处理心肌细胞48h,其MnSOD活性升高最大。3将经缺锰饲粮饲喂7d的肉仔鸡处死后用于鸡心肌细胞培养,将培养5~7d长成单层的心肌细胞分别加入含0.1、0.5、1.0、2mM/L无机硫酸锰的培养基溶液,同时设不加锰的对照组,每个处理3个重复,每个重复2细胞培养孔,在加入培养液后的6、12、24、48h时分别提取细胞的总RNA。经纯化后,用荧光定量PCR法对MnSOD mRNA进行定量。结果表明:用加锰培养基分别培养心肌细胞6、12、48h,各组心肌细胞MnSOD mRNA水平无显著差异,而24h的MnSOD mRNA水平显著高于其它各组,表达量最高。添加0.1mM、0.5mM、1.0mM、2mM/L浓度锰的心肌细胞MnSOD mRNA水平均高于不加锰组的MnSOD mRNA水平,但差异不显著。