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等离子体喷涂钛涂层具有良好的机械性能和生物相容性,其粗糙表面和多孔结构能够允许骨组织长入,形成机械耦合力,提高了界面稳定性,因而被广泛用作硬组织替换材料。然而,钛涂层为生物惰性材料,并不具备生物活性,对骨组织的生长没有促进诱导作用,骨传导和骨整合能力较差。为了赋予钛涂层生物活性并改善其成骨性能,本论文拟采用生物化学改性方法,将细胞外基质主要成分(Ⅰ型胶原和透明质酸)固定在钛涂层表面,制备了生物大分子改性钛涂层。通过体外入骨髓间充质干细胞培养实验评价改性钛涂层的生物活性和细胞相容性;通过动物体内成骨实验评价改性钛涂层的骨传导和骨整合性能;考察生物大分子层的结构、组分对改性钛涂层生物学性能和成骨性能的影响。取得的主要研究成果如下:
(1)分别利用物理吸附和共价键接枝两种固定方法将Ⅰ型胶原固定在钛涂层表面,制备了两种Ⅰ型胶原改性钛涂层(TC-AC和TC-AAC)。胶原定量检测实验结果表明,共价键接枝固定的胶原量约为391±20μg/cm2,远高于物理吸附固定的185±13μg/cm2,前者还表现出更好的稳定性和抗胶原酶降解性能;与原始钛涂层和碱处理钛涂层相比,Ⅰ型胶原改性钛涂层提供了一个有利于细胞-材料相互作用的界面,细胞在其表面呈现出更好的附着和铺展形貌。细胞行为学实验结果表明Ⅰ型胶原改性钛涂层明显地促进了干细胞的粘附、增殖和成骨分化;与物理吸附固定的胶原相比,共价键接枝固定的胶原具有更好的促进效果,这与其良好的固定效果有关。
(2)利用共价键接枝固定法,制备了透明质酸改性钛涂层(TC-AAH)。体外细胞生物学实验结果表明,透明质酸的引入,改善了钛涂层的生物学性能,促进了干细胞的粘附、增殖、迁移和成骨分化。与Ⅰ型胶原改性钛涂层的比较实验结果表明,透明质酸改性钛涂层能够更好地促进细胞的迁移和增殖,而Ⅰ型胶原改性钛涂层更有利于调控细胞的粘附和成骨分化。
(3)将共价键接枝固定法引入层-层(LBL)自组装技术中,提出了改进的LBL技术。利用此方法在钛涂层表面构建了Ⅰ型胶原/透明质酸(Col/HyA)仿生复合膜(TC-AA(C/H)6)。传统LBL技术固定的胶原约为643±50μg/cm2,改进LBL技术固定的胶原量约为670±55μg/cm2,两者之间并没有显著性差异;传统LBL技术制备的复合膜(TC-A(C/H)6)在Tris-HCl溶液中浸泡6天后脱附殆尽,而改进LBL技术构建的Col/HyA复合膜浸泡6天后保留了91±3.1%(浸泡10天后仍保留87±3.7%),表现出更好的固定稳定性。以上结果表明,在改进LBL技术中共价键接枝固定赋予复合膜结构上的稳定性。良好的固定稳定性延长了复合膜发挥效用的时间。细胞实验结果表明,与TC-A(C/H)6相比,TC-AA(C/H)6表现出更好的生物学性能。在与单独Ⅰ型胶原改性或透明质酸改性钛涂层的比较实验中发现,仿生复合膜改性钛涂层中的Ⅰ型胶原和透明质酸表现出良好的协同效应。TC-AA(C/H)6的生物学性能优于TC-AAC和TC-AAH,进一步促进了细胞的粘附、增殖和成骨分化。
(4)动物实验结果表明,钛涂层表面固定生物大分子(Ⅰ型胶原或透明质酸)能有效改善钛涂层的成骨性能,促进骨组织长入钛涂层孔隙,有利于早期的界面成骨,改善材料-骨组织间的界面结合;Ⅰ型胶原和透明质酸在体内成骨中体现出了良好的协同作用,使得Col/HyA仿生复合膜改性钛涂层(TC-AA(C/H)6)的成骨性能优于单一组分的改性钛涂层(TC-AAC和TC-AAH);与传统LBL技术制备的Col/HyA复合膜改性钛涂层相比,改进LBL技术制备的Col/HyA复合膜改性钛涂层具有更快的骨整合速率和更好的成骨性能。这可能是因为改进LBL技术制备的Col/HyA复合膜具有更好的稳定性。