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作为一种多功能的生物活性分子,一氧化氮(nitric oxide,NO)不仅在人体和哺乳动物的生理代谢过程中发挥关键的信号分子作用,而且在植物体中,NO也被认为是一种新的生长调节物质参与植物的生长发育过程。然而,植物内源NO的产生及各种环境因素对NO产生的影响研究较少,本论文首先利用化学发光法研究了不同氮(nitrogen,N)源、光照/黑暗、有氧/无氧及几种环境胁迫条件对大麦幼苗及愈伤组织NO释放的影响;并深入分析了模拟N沉降条件下79个物种的NO释放规律及与叶片N含量、比叶面积(specific leaf area,SLA),净光合速率(netphotosynthetic rate,Pn)和光合N利用效率(photosynthetic Nuse efficiency,PNUE)等叶片性状的关系。其次,以红树林湿地NO释放通量的观测结果为研究基础,首次发现NO可促进红树植物白骨壤叶片的泌盐和Na+区域化,并进一步从生理、蛋白翻译及基因转录等水平对此进行深入探讨。主要结论如下:
1.大麦幼苗离体组织及整体植株的NO释放量对硝酸盐(nitrate,NO3-)/亚硝酸盐(nitrite,NO2-)的处理浓度具有剂量效应,且整体植株的NO释放量显著高于离体组织:(I)中等浓度NO3-(60mM)处理下,NO释放量最高;而对于NO2-处理,NO释放量与处理浓度呈正相关;(ii)与黑暗条件相比,光照条件下大麦幼苗离体根及整体植株NO释放量较高;在无氧条件下,大麦幼苗离体叶或根、愈伤组织及整体植株的NO释放量均显著高于有氧条件;(iii)在环境胁迫处理下,短期高温处理可诱导大麦幼苗及愈伤组织内源NO释放上升,长期处理则降至对照水平:短期高浓度聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG;25％,30％)处理使植株NO释放量显著增加,但随干旱胁迫时间延长NO释放量有所下降;短期盐胁迫使植株NO释放量增加,长期处理则因盐度不同而有所差异,大麦愈伤组织内源NO含量及NO释放速率在中等浓度NaCl短时间处理下显著提高;短期重金属镉和铜处理下,植株NO释放量与对照差异不大,长期镉处理后,植株NO释放显著升高,而长期铜处理只在低浓度下出现释放高峰。
2.为了评价环境N沉降对不同物种NO释放的影响,本研究对模拟N沉降处理下79个物种的NO释放量及叶片N含量、C含量、C∶N比、SLA、Pn和PNUE等叶片性状进行了测定,并按植物系统发生关系和功能类群进行分类,分析其NO释放与各种叶片性状的关系。结果表明:(I)过量N沉降处理可显著增加叶片N水平和SLA,降低Pn和PNUE,同时使NO释放量显著提高;(ii)NO释放量在不同功能类群间存在显著差异,与其他功能类群相比,在模拟N沉降处理下,针叶植物、裸子植物、C3草本植物等功能类群NO释放的增加更为显著;(iii)相关性分析结果表明,N沉降处理下,植物NO释放的增加率与叶片N含量、SLA的增加率及Pn、PNUE的下降率均具有显著的相关性;(iv)过量的N沉降可显著提高针叶植物、裸子植物、C3草本植物等敏感的功能类群的NO释放量,可能对环境大气NO的动态平衡产生重要影响。
3.本研究首次利用动态箱法对福建云霄漳江口红树林(秋茄和白骨壤)湿地NO释放日变化进行观测。研究发现夜间潮汐可明显促进红树林湿地土壤的NO释放,而两样地日间NO释放量均维持在较低水平。室内模拟潮汐实验表明:与光照条件下相比,黑暗模拟潮汐显著提高了NO释放速率,表明强光、高温和干燥可降低红树林湿地土壤的NO释放速率。与秋茄样地相比,白骨壤样地NO日平均释放速率较高,对补N响应较敏感,这种差异与土壤有效N含量,CO2释放速率及微生物种类和活性密切相关。
4.以红树林湿地NO释放量的测定结果为研究基础,我们以泌盐红树植物白骨壤为材料,研究了NO可以通过增加盐腺泌盐和液泡内Na+区域化而对体内离子稳态起到调节的作用。研究表明NO通过提高H+-ATPase和Na+/H+逆向转运蛋白的基因表达进而增加泌盐和Na+区域化来提高白骨壤耐盐性。具体结果如下:(I)在400 mM NaCl处理下,100μM SNP显著提高了叶片表面的盐晶密度、泌盐成分中Na+含量,同时维持叶片内较低的Na+/K+比;(ii)通过X-ray微区分析,100μM SNP处理后,Na+百分比和Na+/K+比在白骨壤叶片盐腺区显著增加,而在叶肉细胞中达到最低值。白骨壤叶片表皮和皮下细胞层中的Na+累积,有利于调节胞内离子稳态提高植物耐盐性;(iii)非损伤微测技术(Non-Invasive Micro-TestTechnology,NMT)研究表明,长期外源SNP处理或SNP瞬时加入都可引起白骨壤盐腺处Na+外流显著增加,而NO合成抑制剂则可逆转NO对Na+流的影响。表明NO通过提高盐腺处Na+流来增加泌盐。质膜H+-ATPase和Na+/H+逆向转运蛋白抑制剂使Na+外流下降,表明盐腺泌Na+与质膜H+ATPase和Na+/H+逆向转运蛋白密切相关;(iv)Western-bolt分析表明中等浓度的NO提高质膜H+-ATPase和液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的表达;(v)为了进一步研究NO促进盐腺泌盐和Na+区域化的分子机理,我们克隆了质膜H+-ATPase(HA1)、质膜Na+/H+逆向转运蛋白(SOS1)、液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX1)的部分基因序列。实时荧光定量RCR分析了质膜及液泡膜H+-ATPase和Na+/H+逆向转运蛋白的基因表达量。四个基因的相对转录水平在100μM SNP处理下最高,并可被NO合成抑制剂逆转。