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大豆作为除小麦、水稻、大麦、玉米外的第五大作物,是一种粮油兼用的作物,具有高蛋白、高油的特征。研究大豆的油脂代谢对于提高大豆的油脂含量很重要。本文主要是鉴定并克隆油脂合成途径中的长链脂酰辅酶A合成酶,研究其在大豆油脂代谢中的作用。长链脂酰辅酶A合成酶(LACSs)主要是把游离脂肪酸活化成为长链酰基辅酶A,参与了若干种与脂肪酸相关的代谢,如脂肪酸链的活化、延伸,磷脂、甘油三酯、茉莉酸的生物合成等,从而在生物脂肪酸的合成代谢和分解代谢中起着重要的作用。
我们从幼苗期大豆中通过RT-PCR分离出了两个长链脂酰辅酶A合成酶基因,命名为GmLACS1和GmLACS2。GmLACS1基因的ORF区共1989 bp,编码662个氨基酸。GmLACS2的ORF区共2202bp,编码733个氨基酸。生物信息学分析显示这两个长链脂酰辅酶A合成酶(GmLACSs)氨基酸序列都具有这类家族的保守域,与其他的LACSs具有高度的相似性,因此初步被认为属于LACS家族。
通过LACS缺陷型酵母YB525互补实验,进一步证明这两个GmLACSs都具有LACS活性。底物偏好性分析表明大豆GmLACSs蛋白都偏好长链脂肪酸。在水解蛋白酶缺陷型酵母pep4中异源表达,结果显示GmLACS1和GmLACS2能够影响宿主酵母的脂肪酸含量,并且GmLACS2能够使酵母油脂和脂肪酸含量降低。为了进一步分析大豆GmLACS2的生物学功能,我们还构建了GmLACS2基因的双元植物表达载体,载体中利用在35S强启动子,然后通过发根农杆菌介导转化大豆发状根。目前已经得到GmLACS2的发状根系。利用索氏抽提和GC-MS初步分析显示:GmLACS2大豆转基因发状根的油脂与对照相比降低了9.77％,同时脂肪酸含量相比对照降低了约30％-50％。
利用荧光定量PCR技术分别分析了GmLACS2在不同大豆组织中的表达,结果显示:GmLACS2在萌发中的种子中表达量最高,同时在幼嫩的组织中有有很高的表达量,从而进一步表明GmLACS2有可能参与了大豆种子中的油脂降解途径。