【摘 要】
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雷州山羊是广东地区的地方优良品种,具有成熟早、耐粗饲、肉质好、膻味低等优点,但由于缺乏科学的选育体系,繁殖力较低。而繁殖性能与卵泡发育紧密相关。卵母细胞所处微环境影响着自身的发育和成熟,卵母在不同的卵泡微环境会面临不同的发育命运。因此,对雷州山羊小卵泡和成熟大卵泡的比较研究有助于了解不同卵泡的基因表达及调控模式,完善卵泡发育过程中的分子机制,为实践中提高雷州山羊的繁殖效力提供理论依据。本研究筛选2
【基金项目】
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广东省乡村振兴战略专项“广东省畜禽地方品种保护与开发利用提升工程”项目（4300-F18260）； 广东省教育厅青年创新人才项目（2017KQNCX014）； 广东省科技厅公益研究与能力建设（2017B020201014,2017A020208050）；
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雷州山羊是广东地区的地方优良品种,具有成熟早、耐粗饲、肉质好、膻味低等优点,但由于缺乏科学的选育体系,繁殖力较低。而繁殖性能与卵泡发育紧密相关。卵母细胞所处微环境影响着自身的发育和成熟,卵母在不同的卵泡微环境会面临不同的发育命运。因此,对雷州山羊小卵泡和成熟大卵泡的比较研究有助于了解不同卵泡的基因表达及调控模式,完善卵泡发育过程中的分子机制,为实践中提高雷州山羊的繁殖效力提供理论依据。本研究筛选2-3岁的健康雷州山羊母羊5头,同期发情后屠宰采集卵巢分离单个卵泡,得到成熟的大卵泡（直径＞8 mm,卵泡壁有丰富的血管包裹）5个,小卵泡（直径＜3 mm）38个,其中每只山羊单个大卵泡为一个重复组,每只山羊5-10个小卵泡组成一个池为一个重复组。利用RNA-Seq和small RNA测序分析雷州山羊大卵泡和小卵泡的基因和miRNA表达谱,并进行差异表达分析、靶基因预测和功能分析。最后通过构建miRNA-mRNA互作调控网络筛选可能与卵泡发育相关的基因、miRNA及相关信号通路。主要结果如下:（1）提取卵泡RNA构建10个RNA-seq文库,测序获得144.82Gb测序数据。从大卵泡vs小卵泡中鉴定出3000个差异表达基因,其中,856个基因在大卵泡中表达上调。差异表达基因显著富集到免疫反应相关和跨膜转运蛋白的活性相关等332个GO Term（244个生物学过程、51个细胞组分和37个分子功能）。KEGG显著富集到类固醇合成、cAMP信号通路及下游相关通路、细胞免疫通路等89个通路。其中NDRG4、HEY2、TC2N、CDO1、FDXR和GADD45B基因可能在卵泡成熟中发挥重要作用。（2）构建了10个small RNA测序文库,测序鉴定出434个已知miRNA,预测到1782个novel miRNA。从大卵泡vs小卵泡中鉴定出44个差异表达miRNA,其中24个miRNA在大卵泡表达上调。miR-202-5p、miR-128-3p和miR-450-5p可能与卵泡发育高度相关。差异表达miRNAs的靶基因功能富集分析miRNA可能通过靶基因参与类固醇激素生物合成、Th17细胞分化、Th1和Th2细胞分化、TGF-β信号通路、Hippo信号通路、MAPK信号通路和细胞粘附因子通路从而参与卵泡发育调控。（3）构建了雷州山羊卵泡发育相关的差异表达miRNA-mRNA互作网络,预测到一个包含14个miRNA和25个基因的调控互作子集合。其中,miR-380-5pPIK3CG/GLI3、miR-494-PIK3CG/GLI3、miR-758-PDE4A/PTCH1和miR-202-5pPDE4A/PTCH1参与大卵泡cAMP信号表达抑制,miR-202-3p-GLI2/PTCH1、miR-296-3p-GLI2/PTCH1参与卵泡Hedgehog信号传导抑制,miR-411a-3p、miR-433和miR-543-3p靶向下调BCL2L11和FGF10参与大卵泡PI3K-Akt信号通路抑制,miR-128-3p、miR-144-3p和miR-411a-3p靶向下调VAV1参与大卵泡的细胞免疫抑制。（4）随机挑选8个差异表达基因和5个差异表达miRNA进行RT-qPCR验证,定量结果与测序结果基本一致,表明测序结果可靠。总之,本研究对山羊大小卵泡基因和miRNA表达谱进行了分析和筛选,为山羊卵泡发育调控的基因和非编码RNA调控机制研究提供数据支持,同时也为雷州山羊品种改良奠定了基础。
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