【摘 要】
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目的本研究旨在采用CRISPR/Cas9系统建立IGR-IIR基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-IIR对HER-2阳性乳腺癌细胞的影响及曲妥珠单抗耐药性机制提供细胞模型。方法根据AAVS1基因序列设计并合成6对sg RNA,使用UCATMCRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与p CS载体连接,筛选效率最高的sg RNA构建Cas9/sg RNA表达载体;用Asi SI+B
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目的本研究旨在采用CRISPR/Cas9系统建立IGR-IIR基因定点整合的SKBR3细胞系,为探究IGF-IIR对HER-2阳性乳腺癌细胞的影响及曲妥珠单抗耐药性机制提供细胞模型。方法根据AAVS1基因序列设计并合成6对sg RNA,使用UCATMCRISPR/Cas9快速构建及活性检测试剂盒分别与p CS载体连接,筛选效率最高的sg RNA构建Cas9/sg RNA表达载体;用Asi SI+Bstz17I酶切将IGF-IIR片段连入h AAVS1-KI载体中,构建IGF-IIR打靶载体,Eco RI+Sca I、Nco I、Bgl II酶切鉴定并测序验证;采用流式细胞技术确定电转染最佳条件,将Cas9/sg RNA载体和IGF-IIR打靶载体以最适电转条件共同转染SKBR3细胞;使用不同浓度嘌呤霉素处理SKBR3,以7天杀死全部细胞为标准,确定最佳筛选浓度后进行筛选,将混合细胞提取基因组,进行PCR鉴定并测序检测,构建IGF-IIR基因定点整合的混合克隆细胞系;采用半固体培养基法及有限稀释法进行单克隆制备。结果成功构建作用于AAVS1位点靶序列的Cas9/sg RNA载体,sg RNA活性检测显示,sg RNA2较sg RNA1、sg RNA3-6优势显著,具有最高效率;酶切鉴定并测序确认IGF-IIR打靶载体构建成功;电转染最佳条件为1200v、20ms、2个脉冲;嘌呤霉素最佳筛选浓度为0.5μg/m L;IGF-IIR打靶载体以及p CS-sg RNA2质粒成功转染HER-2阳性乳腺癌细胞SKBR3,PCR鉴定及测序验证混合克隆片段基因型正确;单克隆细胞因细胞状态差、逐渐凋亡,IGF-IIR过表达在体外抑制了SKBR3的生长。结论成功获得IGF-IIR基因在AAVS1位点定点整合的混合克隆细胞系,为进一步探究IGF-IIR对HER-2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药性影响的机制奠定基础。
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