猪痘（Swinepox,SWP）是由猪痘病毒（Swinepox Virus,SWPV）引起猪的一种以皮肤损伤、形成痘疹和结痂为特征的猪传染病,猪感染后能自行康复,对养猪业造成的损失极小。猪痘病毒具有严格宿主特异性、基因组大（146kb）、复制非必需区（Non-essential Regions,NERs）多和可插入大片段外源基因等特点,特别适合作为基因工程疫苗载体。虽然SWPV作为疫苗载体具有诱人的潜在应用前景,但SWPV能否成为具有应用价值的疫苗载体,一些关键问题仍有待解决:复制非必需区（作为外源基因插入位点）的筛选、强启动子的筛选、毒力基因的鉴定等。本研究以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）表达量高低作为SWPV启动子强弱的判断指标,对SWPV基因组中所有启动子（146个）进行逐个筛选,以期发现SWPV强启动子,为今后构建高效表达外源蛋白的SWPV载体系统研究提供强启动子。1.增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的表达利用原核表达载体pET-32a,构建了重组表达载体pET-32a-EGFP-His,成功表达重组蛋白EGFP-His,重组蛋白以包涵体形式存在,纯化的重组蛋白在可见光下呈无色,SDS-PAGE结果显示重组蛋白EGFP-His大小约为48k Da。以猪痘病毒江西分离株（SWPV-JX20G）为亲本病毒,TK基因为外源基因的插入位点,痘苗病毒（Vaccinai virus,VV）启动子P28作为EGFP的启动子,构建了重组转移载体pSW-P28-EGFP-His,采用同源重组技术获得了表达EGFP的重组猪痘病毒rSWPV-P28-EGFP-His。感染重组猪痘病毒rSWPV-P28-EGFP-His的PK15细胞在荧光显微镜下可见绿色荧光,纯化的重组蛋白EGFP-His在可见光下呈绿色,SDS-PAGE结果显示EGFP-His蛋白的分子量大小约27k Da。2.抗EGFP单克隆抗体的制备以真核表达载体（SWPV载体）表达的EGFP-His为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,分别以真核表达的EGFP-His和原核表达的EGFP-His为检测抗原,采用杂交瘤技术,筛选到9株能稳定分泌抗EGFP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B3、11H6、7E12、9H8、17C8、2F2、9A10、18A6和17H2。ELISA和Western blotting实验结果显示:7株单抗（2F2、4B3、11H6、9H8、17C8、18A6、17H2）均能与真核或原核表达的EGFP-His特异性反应;另外二株单抗（7E12和9A10）仅与真核表达的EGFP-His特异性反应,不与原核表达的EGFP-His反应。由此可推测:7E12和9A10两株单抗针对的抗原表位为EGFP构象表位,其余7株单抗针对的抗原表位为EGFP线性表位。3.猪痘病毒启动子的筛选猪痘病毒基因组含150个开放阅读框（ORFs,SWPV001～SWPV150）,由于SWPV001～SWPV004与SWPV147～SWPV150为反向互补,因此SWPV的启动子只有146个。根据猪痘病毒江西分离株（SWPV-JX20G）全基因序列,设计146对启动子（Px）的PCR扩增引物,以SWPV-JX20G株为亲本病毒、TK基因为插入位点、EGFP作为报告基因、猪痘病毒启动子Px作为报告基因的启动子,构建了146个含Px-EGFP的转移载体,采用同源重组技术获得了146株表达EGFP的重组猪痘病毒rSWPV-Px-EGFP。根据重组猪痘病毒rSWPV-Px-EGFP感染PK15细胞的荧光亮度和Western-bloting结果判断筛选的猪痘病毒启动子强弱,结果表明本试验确定的146个猪痘病毒启动子的启动效果差异极大,可将146个猪痘病毒启动子分为三类:（1）启动效果强于P11的启动子有6个:P026、P033、P067、P069、P109、P150;（2）与P11启动效果相差无几的启动子有8个:P006、P025、P027、P055、P060、P120、P145、P147;（3）其余启动子的启动能力均很弱:P010、P040、P112、P117、P119、P135、P139、P148……等。迄今为止,国内外未见有猪痘病毒启动子鉴定的报道,本研究首次对猪痘病毒基因组中的所有启动子（146个）进行了逐个筛选,并筛选到6个猪痘病毒强启动子（P026、P033、P067、P069、P109、P150）,为今后构建猪痘病毒高效表达载体的研究打下基础。