隐孢子虫属于水源性顶复门寄生虫,是一种重要的胞内寄生虫。目前硝唑尼特是FDA唯一批准的治疗隐孢子虫病的药物,但对免疫缺陷病人无效。因此,阐明微小隐孢子虫对宿主细胞黏附与入侵的机制对防控微小隐孢子虫至关重要。整合素是一种跨膜蛋白,可以促进细胞与细胞外基质(ECM)的黏附,激活信号传导途径,介导细胞信号(如细胞周期)的调节,细胞内骨架的组装,以及新受体向细胞膜的运动。目前,整合素样蛋白已经在很多寄生虫如疟原虫和弓形虫中发现,其通过与宿主细胞表面的硫化肝素分子相互作用介导虫体对宿主细胞的黏附。相关研究表明,肝素以及硫化肝素可以有效抑制微小隐孢子虫子孢子与宿主细胞的黏附。但目前对微小隐孢子虫的含整合素结构域蛋白的研究还没有报道。在本实验中,选取微小隐孢子虫含整合素α结构域的蛋白质为研究对象,对其进行亚细胞定位和相关黏附功能的研究。首先,利用生物信息学的方法对微小隐孢子虫的整合素样蛋白质(CpITGA)的序列进行分析。然后对CpITGA进行原核表达并纯化重组蛋白质。利用HIS标签重组蛋白免疫家兔获得多克隆抗体,随后用Western blot对天然虫体蛋白进行验证,并检测多克隆抗体的特异性。通过间接免疫荧光的方法对CpITGA进行亚细胞定位。分别提取微小隐孢子虫卵囊、子孢子及虫体入侵细胞不同时期的总RNA,用荧光定量PCR的方法对CpITGA基因的转录水平进行分析。为了研究该蛋白是否在虫体入侵宿主细胞的过程中起到作用,利用GST标签重组蛋白质通过细胞ELISA、间接免疫荧光以及流式细胞术分析GST-CpITGA与宿主细胞的结合情况。通过重组GST-CpITGA蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制重组蛋白质与肝素磁珠结合试验、肝素钠盐抑制重组蛋白与HCT-8细胞结合试验以及用肝素酶将HCT-8细胞表面硫化肝素移除后,重组蛋白质与宿主细胞的结合试验,验证硫化肝素作为GST-CpITGA结合HCT-8细胞的受体。最后,通过荧光定量PCR的方法评价抗CpITGA-HIS多克隆抗体阻断虫体入侵HCT-8细胞的效果。生物信息学分析表明,微小隐孢子虫整合素样蛋白(CpITGA)含有4个整合素样结构域,一个N端信号肽,一个C端跨膜区,一个短的胞质尾区以及3个糖胺聚糖结合基序。以Cp18S作为内参进行荧光定量PCR,结果表明CpITGA基因在虫体各个时期均有转录,在虫体入侵HCT-8细胞12 h时转录水平最高。Western blot结果表明抗CpITGA多克隆抗体能够特异性识别大小为120 kDa的虫体天然蛋白。间接免疫荧光实验表明CpITGA定位在微小隐孢子虫子孢子和裂殖子的表膜。根据整合素α结构域以及糖胺聚糖结合基序所在的位置原核表达并纯化出可溶性重组蛋白质GST-CpITGA,利用细胞ELISA,间接免疫荧光以及流式细胞术分析重组蛋白质与宿主细胞的结合情况,结果显示GST-CpITGA能够与宿主细胞结合,其结合呈剂量依赖性和可饱和性。进一步研究发现,GST-CpITGA能够与肝素磁珠结合,并且这种结合可以被肝素钠盐所抑制,而硫酸软骨素没有抑制效果,表明GST-CpITGA与肝素磁珠的结合是特异的,同时,肝素钠盐可以抑制重组蛋白与HCT-8细胞的结合,并且当用肝素酶移除宿主细胞表面的硫化肝素时,重组蛋白与宿主细胞的结合能力明显下降。最后,抗体体外抑虫结果表明,抗CpITGA抗体能够显著抑制微小隐孢子虫入侵宿主细胞,其抑制效果呈剂量依赖性,当抗体浓度为100μg/mL时,抑制率达到55%。综上所述,CpITGA通过与宿主细胞表面硫化肝素的结合参与了微小隐孢子虫的黏附过程,有望成为防治微小隐孢子虫病的靶标及疫苗候选抗原。