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西瓜噬酸菌是革兰氏阴性细菌,主要为害西瓜和甜瓜,造成严重的经济损失,其致病机理目前尚不清楚。植物病原细菌T3SS分泌的Ⅲ型效应蛋白(T3Es)可以抑制植物免疫反应,其为致病过程中的关键因子。过去的报道证实T3SS是西瓜噬酸菌致病过程中的决定性因素,但西瓜噬酸菌中T3Es的研究却鲜有报道。为此,本研究展开了西瓜噬酸茵T3Es鉴定以及功能分析的研究。 (1)西瓜噬酸菌中T3SS潜在调控基因hrpG以及hrpX的功能研究 hrpG及hrpX参与调控生物膜的形成,促进了西瓜噬酸菌激发非寄主普通烟HR的能力,增强了西瓜噬酸菌激发寄主本氏烟ROS爆发,且对致病性有重大贡献,更重要的是其参与调控T3Es的表达。 (2)西瓜噬酸菌中候选Ⅲ型效应蛋白的初步筛选研究 本研究对野生型菌株Aac5、hrpG及hrpX突变株进行了转录组测序,获得了大量差异基因。本研究还利用生物信息学方法预测了西瓜噬酸菌中潜在的T3Es,结合转录组差异基因综合分析确定了20个候选基因,并对20个基因进行了初步筛选,从中获得了4个候选基因作为接下来的研究对象。 (3)西瓜噬酸菌潜在Ⅲ型效应蛋白Ace1的鉴定及功能分析 以ace1基因作为研究对象,通过Western blot、qPCR、启动子活性测定等方法验证ace1为一个新的Ⅲ型效应蛋白。功能分析证实Ace1在西瓜噬酸菌侵染天然寄主西瓜过程中起到促进作用;Ace1抑制寄主本氏烟ROS爆发及胼胝质沉积;Ace1蛋白在寄主本氏烟中可以定位于整个细胞;Ace1抑制Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000菌株中AvrPto效应蛋白诱导的本氏烟PCD;利用免疫共沉淀及质谱分析,本研究获得了Ace1在本氏烟中潜在的互作靶标蛋白,双分子荧光技术以及qPCR技术证实其可能存在互作关系,但仍需进一步验证。 (4)光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌致病性差异分析 光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌致病因子表达及其与寄主互作过程中诱导寄主抗性反应存在显著差异,光照条件抑制西瓜噬酸菌的致病能力;在光照条件下西瓜噬酸菌中lov基因抑制运动能力,但lov缺失后对整体致病能力影响不显著;iTRAQ技术分析表明光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌差异表达蛋白77个,涉及多条致病代谢通路,且筛选到一个受到黑暗诱导表达的潜在的Ⅲ型效应蛋白。 综上,本研究确定了西瓜噬酸菌中hrpG及hrpX参与调控T3Es的表达;初筛获得了西瓜噬酸菌中4个潜在的T3Es,其中Ace1确定为一个Ⅲ型效应蛋白,并发现Ace1能抑制植物的免疫反应;发现光照及黑暗条件下西瓜噬酸菌致病性存在差异。这些为后续西瓜噬酸菌分子致病机理的解析奠定了重要基础。