论文部分内容阅读
壳聚糖酶(Chitosanase EC 3.2.1.132)能催化壳聚糖中糖苷键的水解生成壳寡糖,壳寡糖被广泛应用在医药、保健品、食品、生物控制剂等方面,利用基因工程构建高产壳聚糖酶的工程菌对相关工业具有深远的意义。本实验从大连周边海域的海泥中筛选出两株壳聚糖酶产生菌,通过对其进行分子生物学鉴定,从中克隆壳聚糖酶基因,构建了其大肠杆菌表达载体,为其高效表达奠定了基础。主要结论包括：1.从大连周边海域的海泥中筛选出两株壳聚糖酶产生菌,16S rDNA比对确定一株细菌为芽孢杆菌属,且与炭疽杆菌亲缘关系较近。2.设计一对特异引物,从炭疽杆菌W-2 (Bacillus authracis strain W-2)的基因组中克隆得到了一段约500bp的片段,将该片段与pMD20-T载体连接后转化至大肠杆菌DH5a中,经对重组质粒进行鉴定及测序,该片段为一486bp的壳聚糖酶基因片段chiW。并与NCBI上已发布的芽孢杆菌属壳聚糖酶编码区序列进行比对分析。结果表明,该片段与来自糖苷水解酶46家族中的Bacillus subtilis和Bacillus sp. KFB-CO4的壳聚糖酶编码区序列一致性分别为41.75%和45.93%；与糖苷水解酶8家族中的Bacillus sp.No.S-1的壳聚糖酶编码区序列一致性为52.91%。因而初步推断该片段为类似壳聚糖酶基因片段。将chiW克隆到pET28a载体中,构建重组表达质粒,转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导其表达。利用SDS-PAGE电泳分析表达的蛋白质的分子量约为66.4KD与43.3KD之间的表达蛋白。3.对chiW的生物信息学分析表明,其拟表达蛋白质的分子式为C809H1181N201O209S13,分子量计算值为17,483.2Da,理论等电点为8.63,其N-末端为Met是疏水性稳定蛋白,α-螺旋占21.48%、p-折叠占38.93%、无规则卷曲占39.06%