稻瘟菌硫还原氧化蛋白Trx及禾谷镰刀菌特有的分泌蛋白的功能研究

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在自然界中,植物持续不断的遭受到外界生物或者非生物的不利环境的胁迫,其中前者包括病原细菌、真菌、卵菌、病毒、线虫、昆虫等。在植物-病原菌共进化过程中,他们形成了复杂的互作关系,植物建立了许多的识别和抗性机制来阻止和限制病原菌的侵染,同时,病原菌形成了多种多样的致病机制以图躲避或者克服植物抗病机制。水稻和小麦是世界上最主要的两种粮食作物,而病原真菌是其产量和质量的重要威胁。稻瘟菌为异宗配合的子囊菌,它是水稻上的重要病害,影响全球所有的水稻产区,造成巨大的水稻产量损失,稻瘟菌也是研究真菌-植物互作的模式真菌;禾谷镰刀菌为同宗配合的子囊菌,主要引起小麦和大麦的赤霉病,也可以造成玉米的穗腐病,该病原菌除了直接造成严重的作物产量和质量损失外,还可以产生多种有害的真菌毒素,如脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和玉米烯酮等。本论文主要着眼于这两种主要的模式真菌,对涉及信号通路的致病相关基因Trx和在侵染时期可能作为效应蛋白发挥作用的致病因子进行深入研究。主要的研究结果和结论如下:1.稻瘟菌中,Mst11-Mst7-Pmk1 MAP激酶信号通路是附着胞形成和侵染型菌丝生长所必备的。在人类和哺乳动物中,氧化还原状态能够影响MAPK激酶的二聚化和下游激酶的激活,为了研究它们在MAPK信号通路中的作用,我们在稻瘟菌中鉴定了2个硫还原氧化蛋白基因:TRX1和TRX2,并通过基因定点敲除技术得到了各自的突变体和双敲除突变体。TRX2在生长发育的各个阶段都具有比TRX1更高的表达水平,是主要的硫氧化还原蛋白。trx1突变体没有明显的表型变化,而trx2突变体在分生孢子形成和孢子形态方面都有严重的缺陷,定量PCR结果显示trx2突变体中COM1、HTF1和CON7等转录因子基因的表达水平都下调。另外trx2在营养生长、光信号、氧化剂和细胞壁压力应答及侵染型菌丝生长方面都有显著的表型缺陷。TRX2缺失也导致细胞外过氧化物酶和漆酶含量明显降低。trx1 trx2双敲除突变体具有比trx2缺失突变体更加显著的的表型变化,并且在侵染水稻时完全不致病。trx2和trx1 trx2突变体孢子萌发的芽管可以形成正常的附着胞,但是其菌丝头却不能形成附着胞,这说明TRX2在附着胞形成方面具有重要的功能而且存在组织特异性。另外,trx1 trx2双敲除突变体在寄主表面不能穿透寄主角质层形成侵染钉进而产生球根状分枝的侵染型菌丝。磷酸化实验表明trx2和trx1 trx2突变体中的Pmk1的磷酸化水平显著下降,特别在双敲除突变体中几乎检测不到磷酸化的Pmk1。co-IP和非变性胶的Western blot显示:在野生型菌株中,Mst7可以自身互作并形成二聚体,但是在trx2突变体中,我们可以在SDS-PAGE蛋白胶中检测到正确大小的Mst7-3xFLAG或-GFP融合蛋白,但是在非变性胶中并不能检测到相应的蛋白条带,这说明TRX2缺失可能影响了Mst7的正常折叠和分子内或分子间的互作和检测。Mst7蛋白中含有4个保守的半胱氨酸残基,通过点突变我们发现305位的半胱氨酸对Mst7的功能和蛋白的检测时非常重要的。另外,我们通过co-IP验证发现Trx2与Mst7可以直接互作,而且持续表达显性激活的MST7可以部分回复trx1 trx2突变体的表型缺陷。综合起来,我们的数据表明稻瘟菌中的硫氧化还原蛋白在细胞内ROS信号传递、分生孢子形成和致病力方面均具有重要的作用,其中TRX2作为主要的TRX基因,可以通过影响Mst7的激活进而影响下游Pmk1 MAPK信号通路从而调控稻瘟菌在寄主植物细胞的穿透和侵染型菌丝生长。2.为了成功侵入和定殖寄主植物,病原真菌产生了多种的效应子蛋白来抑制植物的免疫反应。大多数的效应子是富含半胱氨酸并且可以在侵染过程中发挥作用的分泌蛋白。我们通过生物信息学鉴定了53个在GenBank数据库及其他已测序真菌基因组中没有同源基因的禾谷镰刀菌特有的候选分泌蛋白。通过基因敲除技术我们得到了所有53个基因的敲除突变体,并对它们的基本表型进行了系统的分析,包括:营养生长、产孢、有性生殖、DON含量和致病力等。其中,我们发现有三个基因对植物侵染很重要。sup1突变体侵染小麦和玉米时致病力都下降,而sup2和sup4突变体只在侵染小麦时致病力下降,不影响玉米的侵染。PVX系统的瞬时表达实验表明这三个基因都能够在烟草和小麦叶片上抑制Bax和InF1诱导的细胞坏死。定量PCR结果显示SUP2和SUP4在侵染小麦穗头72h的表达水平相对于营养菌丝中的剧烈上调。我们分别构建了含有和不含信号肽的Sup2/4-GFP载体,并将它们分别转化进各自的突变体中,然后通过观察转化子的荧光定位情况发现这两个蛋白均是真正的分泌蛋白。Live-cell成像技术显示Sup2和Sup4分泌蛋白在侵染时期主要积累在菌丝-植物界面并且可能被运输进入小麦细胞中。通过对Sup2的8个半胱氨酸位点进行点突变分析发现:Cys84和Cys105对Sup2的全毒性和蛋白的运转非常重要。另外,我们通过酵母双杂交技术筛选到5个可能与Sup2互作的小麦基因,分别是:磷酸乙醇酸磷酸酶、半胱氨酸降解酶、膜相关蛋白多聚乙酰环化酶、真核生物翻译起始因子和扩展蛋白EXPA7。综上所述,这些结果表明Sup2和Sup4可能是禾谷镰刀菌中对小麦侵染非常重要的两个新的效应蛋白。
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