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目的
本课题采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)诱导的帕金森病(Parkinsons disease, PD)小鼠模型,观察电针(Electroacupuncture, EA)刺激对PD小鼠运动功能的影响,进而探究EA刺激是否通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路,发挥对中脑黑质(Substantia nigra, SN)部多巴胺(Dopaminergic, DA)能神经元的保护作用。
方法
1.建立PD模型小鼠,EA刺激进行治疗
用MPTP(30 mg/kg)连续腹腔注射7d,建立PD模型小鼠。EA治疗组小鼠用EA刺激百会、阳陵泉穴连续14d;阳性对照组小鼠用Madopar(12 mg/kg)连续灌胃14d;空白对照组小鼠给予相同体积的生理盐水。
2.EA刺激在改善PD小鼠运动功能中的作用
待最后一次EA、给药处理结束后,在旷场、转棒和爬杆实验中开始行为学测试。
3.EA刺激改善PD小鼠运动功能的作用机制研究
3.1PD小鼠中脑SN部小胶质细胞的改变
免疫荧光染色(Immunofluorescence staining, IF)法观察,PD小鼠SN部小胶质细胞的标志物Iba-1的表达水平。
3.2EA刺激对PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路的影响
蛋白免疫印迹(Western blot, WB)法检测,PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路中蛋白(NLRP3、Caspase-1、IL-1β)的表达水平。
3.3PD小鼠SN部DA能神经元的改变
IF法观察,PD小鼠SN部DA能神经元的标志物,酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的表达;WB法检测TH的表达水平。
4.探究EA治疗PD与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的相关性
4.1建立PD模型小鼠,用NLRP3的抑制剂Mcc950,及EA刺激进行处理
采用MPTP(30 mg/kg)连续腹腔注射7d,建立PD模型小鼠。Mcc950组用Mcc950(20 mg/kg)连续灌胃14d;EA组用EA连续刺激百会、阳陵泉穴14d;Mcc950+EA组用Mcc950灌胃及EA刺激连续处理14d;对照组给予相同体积生理盐水。
4.2验证EA抑制NLRP3/CASPASE-1/IL-1Β信号通路中相关蛋白表达的升高
WB法检测,PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路(NLRP3、Caspase-1、IL-1β)蛋白表达水平的变化。
4.3通过行为学方法,验证EA抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路发挥治疗PD的作用
待最后一次EA、给药处理结束后,在旷场、转棒和爬杆实验中进行行为学测试。
结果
1.EA刺激可改善PD小鼠的运动功能
行为学结果显示,MPTP组小鼠的运动能力显著下降,给予EA刺激后,可显著改善PD小鼠的运动功能。
2.EA刺激在改善PD小鼠运动功能中的作用机制研究
2.1EA刺激可显著抑制PD小鼠SN部小胶质细胞的过度活化
IF结果显示,MPTP组小鼠SN部小胶质细胞标志物Iba-1的表达显著升高,给予EA刺激后,可显著降低Iba-1的表达。
2.2EA刺激可抑制PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路中蛋白的表达
WB结果显示,与空白组相比,MPTP组小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路中蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平显著升高;给予EA刺激后,可显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平。
2.3EA刺激可增加PD小鼠SN部DA能神经元的表达
IF和WB结果显示,MPTP组小鼠SN部TH的表达水平显著降低,给予EA刺激后,可显著增加TH的表达。
3.探究EA治疗PD与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的相关性
3.1验证EA抑制NLRP3/CASPASE-1/IL-1Β信号通路中相关蛋白表达的升高
WB结果显示,与空白组相比,MPTP组小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路中蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平显著升高;给予Mcc950处理后,可显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平,与给予EA刺激后的结果一致;同时给予Mcc950和EA刺激后,可显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平,而且,与单独EA刺激相比,可协同抑制此信号通路的表达。
3.2进一步验证,EA通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路发挥治疗PD的作用
行为学结果显示,MPTP组小鼠的运动能力显著下降,给予Mcc950后,可显著改善PD小鼠的运动功能,与给予EA治疗后的效果相似。
结论
本研究证明,通过腹腔注射MPTP成功建立PD模型小鼠;给予EA治疗后,明显改善PD小鼠的运动功能。进一步的机制研究发现,EA刺激抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路,改善PD模型小鼠的神经炎症,同时保护DA能神经元;另外,EA刺激和Mcc950可以协同作用抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路,发挥对PD的治疗效果。因此,EA刺激很可能是通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路来保护DA能神经元,最终改善PD小鼠的运动功能。
本课题采用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP)诱导的帕金森病(Parkinsons disease, PD)小鼠模型,观察电针(Electroacupuncture, EA)刺激对PD小鼠运动功能的影响,进而探究EA刺激是否通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路,发挥对中脑黑质(Substantia nigra, SN)部多巴胺(Dopaminergic, DA)能神经元的保护作用。
方法
1.建立PD模型小鼠,EA刺激进行治疗
用MPTP(30 mg/kg)连续腹腔注射7d,建立PD模型小鼠。EA治疗组小鼠用EA刺激百会、阳陵泉穴连续14d;阳性对照组小鼠用Madopar(12 mg/kg)连续灌胃14d;空白对照组小鼠给予相同体积的生理盐水。
2.EA刺激在改善PD小鼠运动功能中的作用
待最后一次EA、给药处理结束后,在旷场、转棒和爬杆实验中开始行为学测试。
3.EA刺激改善PD小鼠运动功能的作用机制研究
3.1PD小鼠中脑SN部小胶质细胞的改变
免疫荧光染色(Immunofluorescence staining, IF)法观察,PD小鼠SN部小胶质细胞的标志物Iba-1的表达水平。
3.2EA刺激对PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路的影响
蛋白免疫印迹(Western blot, WB)法检测,PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路中蛋白(NLRP3、Caspase-1、IL-1β)的表达水平。
3.3PD小鼠SN部DA能神经元的改变
IF法观察,PD小鼠SN部DA能神经元的标志物,酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)的表达;WB法检测TH的表达水平。
4.探究EA治疗PD与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的相关性
4.1建立PD模型小鼠,用NLRP3的抑制剂Mcc950,及EA刺激进行处理
采用MPTP(30 mg/kg)连续腹腔注射7d,建立PD模型小鼠。Mcc950组用Mcc950(20 mg/kg)连续灌胃14d;EA组用EA连续刺激百会、阳陵泉穴14d;Mcc950+EA组用Mcc950灌胃及EA刺激连续处理14d;对照组给予相同体积生理盐水。
4.2验证EA抑制NLRP3/CASPASE-1/IL-1Β信号通路中相关蛋白表达的升高
WB法检测,PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路(NLRP3、Caspase-1、IL-1β)蛋白表达水平的变化。
4.3通过行为学方法,验证EA抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路发挥治疗PD的作用
待最后一次EA、给药处理结束后,在旷场、转棒和爬杆实验中进行行为学测试。
结果
1.EA刺激可改善PD小鼠的运动功能
行为学结果显示,MPTP组小鼠的运动能力显著下降,给予EA刺激后,可显著改善PD小鼠的运动功能。
2.EA刺激在改善PD小鼠运动功能中的作用机制研究
2.1EA刺激可显著抑制PD小鼠SN部小胶质细胞的过度活化
IF结果显示,MPTP组小鼠SN部小胶质细胞标志物Iba-1的表达显著升高,给予EA刺激后,可显著降低Iba-1的表达。
2.2EA刺激可抑制PD小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路中蛋白的表达
WB结果显示,与空白组相比,MPTP组小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路中蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平显著升高;给予EA刺激后,可显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平。
2.3EA刺激可增加PD小鼠SN部DA能神经元的表达
IF和WB结果显示,MPTP组小鼠SN部TH的表达水平显著降低,给予EA刺激后,可显著增加TH的表达。
3.探究EA治疗PD与NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路的相关性
3.1验证EA抑制NLRP3/CASPASE-1/IL-1Β信号通路中相关蛋白表达的升高
WB结果显示,与空白组相比,MPTP组小鼠SN部NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路中蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平显著升高;给予Mcc950处理后,可显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平,与给予EA刺激后的结果一致;同时给予Mcc950和EA刺激后,可显著降低NLRP3、Caspase-1、IL-1β的表达水平,而且,与单独EA刺激相比,可协同抑制此信号通路的表达。
3.2进一步验证,EA通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路发挥治疗PD的作用
行为学结果显示,MPTP组小鼠的运动能力显著下降,给予Mcc950后,可显著改善PD小鼠的运动功能,与给予EA治疗后的效果相似。
结论
本研究证明,通过腹腔注射MPTP成功建立PD模型小鼠;给予EA治疗后,明显改善PD小鼠的运动功能。进一步的机制研究发现,EA刺激抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路,改善PD模型小鼠的神经炎症,同时保护DA能神经元;另外,EA刺激和Mcc950可以协同作用抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β炎性信号通路,发挥对PD的治疗效果。因此,EA刺激很可能是通过抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路来保护DA能神经元,最终改善PD小鼠的运动功能。