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医学研究表明:许多疾病如癌症和遗传病的发生都与基因的突变有关,因此对特定序列DNA的分析、检测在基因筛选、法医鉴定、遗传疾病的早期诊断和治疗等方面具有十分深远的意义。特定序列DNA检测由于具有所需时间短、样品消耗少、分析成本低等突出优点,一直吸引着各国学者的关注,检测方法包括电化学法、分光光度法、酶法、荧光法、同位素法和化学发光法(CL)等。各种方法各有优缺点,其中电化学法、酶法、荧光法、CL法在近几年发展迅速。
化学发光(CL)分析法不需光源,仪器设备简单、操作简便,具有极高的灵敏度,目前已成功地应用在药学、生物学、分子生物学、临床医学和环境学等诸多领域。金纳米微粒制备过程简单,价格便宜,制备的纳米微粒标记物性质稳定,生物活性损失小,是一种理想的标记分子。因此,本论文以金纳米微粒为标记物,采用CL分析法,发展了一种具有创新意义的基于金纳米微粒的CL特定序列DNA分析法,整个论文由以下三个部分构成:
(1)绪论:介绍了特定序列DNA检测的研究进展及其意义;以不同的标记物分类,包括:金属离子标记、DNA酶标记、以及基于酶标记的DNA检测技术等。介绍了特定序列DNA分析方法的研究进展,并列举了近年来它们在该分析领域的典型示例。
(2)基于磁性微球和金纳米微粒的特定序列DNA化学发光检测新技术:乙型病毒性肝炎作为一种世界性的疾病,已经受到公众和政府部门的高度重视。乙肝病毒快速、有效的检测对乙肝诊断、治疗,以及控制其传染等方面具有重要的意义。
本章建立了一种基于羧基磁性微球和金纳米微粒的DNA化学发光检测新技术,首先固定捕获探针在磁性微球表面,与目标DNA杂交,再与报告序列修饰的金纳米微粒标记物杂交,随后采用鲁米诺.硝酸银体系直接检测目标DNA。文中以含35个碱基的乙肝病毒DNA片段作为分析物,DNA检测的线性范围为0.1-100fmol(R2=9819),检测限为50amol。
(3)基于96孔板和金纳米微粒的特定序列DNA化学发光检测新技术:对于金纳米微粒的检测,传统的方法相对耗时长,操作复杂,常常需要特殊的技术步骤;因此需要开发出一种快速、简单、易用而又灵敏度高的DNA检测方法。
本章建立了一种基于96孔板和金纳米微粒的DNA化学发光检测新方法及其放大技术,首先固定捕获探针在96孔板表面,与目标DNA杂交,再与报告序列修饰的金纳米微粒标记物杂交,反应完成后加入NH20H和HAuCL4,进行羟胺方大反应,最后采用鲁米诺.硝酸银体系直接检测目标DNA。DNA检测的线性范围为0.0025.1fmol(R2=0.9874),检测限为0.8amol。