研究背景：脊髓损伤(SCI)后的再生修复和功能重建一直是医学界难以解决的问题。SCI在大多数国家的年发病率为20-40/100万,在我国随着经济的快速发展和交通运输效率的不断提高而呈逐年上升趋势。SCI后致残率高,常常导致截瘫等严重功能障碍,给患者及其家庭和社会带来极其沉重的经济和社会负担。一直以来,人们认为中枢神经系统(CNS)没有再生能力,自从Richardson在《Nature》上发表论文,中枢神经系统的再生能力才被人们逐渐认知。近年来的实验结果表明,CNS的再生修复能力与细胞的类型、发育程度以及细胞与损伤位置的距离有关,也与损伤后髓磷脂降解产生废物,离子稳态破坏,神经递质释放改变,递质受体功能障碍以及免疫炎性反应有关。同时,脊髓损伤往往会改变脊髓复杂的解剖结构,损害脊髓正常生理功能,所以损伤后恢复相应的解剖结构是功能恢复的必要前提。组织工程材料以其良好的力学性能及可塑性等优点逐渐成为脊髓损伤后再生修复的一个可能方向。众多研究表明,生物材料作为神经干细胞的载体,既可以承载神经营养因子等细胞因子,又可以为损伤后的脊髓提供力学支撑,减少创伤区域的瘢痕形成。理想的生物材料应具有良好的组织相容性,并且较少或完全不会引起其他不良反应；具有优秀的可塑造性及力学特性,以便于加工成为各种目标形态；若想承载细胞,需有良好的界面使细胞便于粘附生长；还应有稳定的或可调节的降解速率,以便适应不同细胞、营养因子发挥作用的时间；并且降解产物应无毒副作用。常见的组织工程材料主要有：(1)天然可降解聚合物；(2)人工合成可降解聚合物；(3)人工合成非可降解聚合物；(4)复合材料。这些材料的应用形式有支架、微球、电纺丝膜片、套管等。脊髓损伤后可应用的药物除了甲基强的松龙得到普遍的认可和使用外,其他药物尚未获得广泛认可或者由于其他的限制因素无法实际应用。目前有多种药物在实验中显示出了良好的效果,包括类固醇、阿片受体拮抗剂、抗脂质过氧化反应剂、神经生长因子、环磷酸腺苷(cAMP)和硫酸软骨素酶ABC (ChABC)等。本文研究探讨了可降解高分子生物材料聚碳酸亚丙酯(PPC)电纺丝和壳聚糖微球复合材料缓释载体的制作方法,以及其在脊髓损伤修复中应用的可行性,并研究了以该缓释材料为载体局部缓释不同药物对脊髓损伤后轴突再生及功能重建的作用。制作生物可降解载药高分子材料由于载药缓释材料良好的生物相容性,可降解性与持续释放药物等特点,其在脊髓损伤中的应用研究日渐增多。多数高分子可降解材料均在体内降解为酸性物质,有可能为脊髓损伤部位带来二次损伤,所以本研究选用了PPC,其可在体内最终降解为二氧化碳和水,且拥有很好的生物相容性；壳聚糖具有优异的生物相容性及可降解性,可以溶于水,为荷载蛋白类药物并保持其活性提供可靠保障。各缓释材料制作简述如下：制备单独载db-cAMP的PPC电纺丝:称量过的PPC原料和db-cAMP粉末放入30mm×50mm的小烧杯中,加入乙腈,搅拌6小时,得到乳白色均匀溶液。溶液中db-cAMP与PPC的质量比为1：9。利用静电纺丝机进行纺丝,使用接地的锡纸作为接收装置,得到单独载db-cAMP的电纺丝膜片。制备含ChABC的壳聚糖微球：称量过的壳聚糖(CS)粉末放入30mm×50mm的小烧杯中,加入1%乙酸水溶液,搅拌6小时,得到溶液A。准确称量聚乙烯毗咯烷酮(PVP)粉末,配制1%的PVP水溶液,微热搅拌3小时,放入4℃冰箱中,得到溶液B。取ChABC,加入上述PVP水溶液中,搅拌得到溶液C。将溶液C与溶液A混合,搅拌均匀后,得到溶液D。配置1%的多聚磷酸钠水溶液,将溶液D缓慢滴加到多聚磷酸钠水溶液中,滴完搅拌3小时,得到乳状浑浊液,将此浑浊液离心分离,离心力2000g,并用水洗两次,沉淀冻干,获得含有ChABC的CS微球。制备含有ChABC的电纺丝-微球和含有ChABC与db-cAMP的电纺丝-微球膜片：将得到的含有ChABC的CS微球定量加入二氯甲烷中,进行超声分散10分钟,然后加入PPC原料和db-cAMP粉末,搅拌至固体全部溶解,得到乳白色溶液。利用静电纺丝设备进行纺丝,使用接地的平整锡箔纸作为接收装置。喷头至锡箔纸距离为15cm,纺丝电压为10kV。收集到载药纤维,得到电纺丝-微球载药纤维复合膜；前法中不加db-cAMP粉末即得到只含ChABC的电纺丝-微球膜片。建立大鼠脊髓损伤模型本实验希望通过研究载药缓释材料在脊髓损伤中的应用,了解高分子缓释材料在脊髓损伤治疗中的应用可能性,并观察损伤后轴突的再生情况,观察再生轴突是否可以穿透胶质瘢痕。有鉴于此,我们选择了便于观察轴突再生的损伤模型-大鼠脊髓半横断模型。造模过程简述如下：雌性Wister大鼠(200-230g)腹腔注射麻醉后固定于手术台上,剃毛消毒后,充分暴露T7-T9脊椎棘突,咬除T8棘突,打开椎弓板,辨认后正中动脉,用11号刀垂直切入脊髓,半横断右侧脊髓,确认止血后,根据分组不同,分别植入相应的载药缓释材料,逐层缝合。术后给予20万U/天青霉素,2ml腹腔注射,每日一次,连续三天,术后对大鼠进行腹部按摩,帮助其排尿,每日三次,直至其恢复自主排尿。单独载db-cAMP电纺丝在大鼠脊髓半切模型中应用的可行性及其效果的研究损伤模型造好之后,载药材料植入横断损伤部位,缝合伤口,给予术后护理。在第1,2,3,4周各时间点采用BBB评分观察评价大鼠后肢运动功能恢复情况,并取材。免疫荧光以及免疫组化染色观察轴突再生、瘢痕形成、空洞形成等指标,用于评价各载药材料对大鼠脊髓半切损伤后轴突再生以及功能恢复的作用。单独载db-cAMP的生物可降解材料PPC电纺丝在大鼠脊髓半切损伤治疗的应用中,PPC和db-cAMP的混合溶液,做成电纺丝膜片。然后在体外模拟体内环境检测db-cAMP的释放数据,得到其释放曲线。结果显示,我们的电纺丝材料可以把db-cAMP的释放时间延长至8天,并且释放速度稳定。在SCI后第1,2,3,4周各时间点应用BBB评分量表对大鼠运动功能进行评价,而后借助免疫荧光和免疫组化技术对损伤区域的轴突再生和瘢痕形成进行研究。BBB结果显示植入载药电纺丝膜片组(实验组)大鼠功能恢复比对照组以及空白PPC组好,免疫组化和免疫荧光结果显示实验组大鼠有更多的轴突长入胶质瘢痕,轴突再生更活跃,并且损伤部位瘢痕更薄。实验结果证明PPC载药电纺丝膜片可以在大鼠脊髓损伤的治疗中应用,为脊髓损伤的治疗提供了一个新的给药选择。联合db-cAMP和ChABC材料与单独用药的效果比较研究我们在PPC电纺丝载药材料的基础上,引入了CS微球,把蛋白类药物ChABC和静电纺丝联合起来,拓宽了蛋白类药物在脊髓损伤治疗中的应用渠道,也增加了脊髓损伤的治疗手段。再次验证了生物可降解高分子材料PPC电纺丝和壳聚糖微球载药体系在脊髓损伤局部缓释药物的可行性。同时验证了小分子化学药物db-cAMP和大分子蛋白类药物ChABC在脊髓损伤局部缓释的作用。实验证明,上述两种单药应用都各自具有一定效果,但促进轴突再生和功能恢复的作用并非十分显著。考虑到脊髓损伤修复障碍由不同因素构成,因此本实验进行药物联合应用,研究电纺丝-微球载药系统同时荷载两种药物的可行性,验证其联合应用时在脊髓损伤的再生修复方面有无协同作用,在缓释方面有无相互影响,并分别和单独给药相比较。检测单独载药和联合载药材料中药物的体外释放曲线,结果显示,与单独载药时相比较,联合载药时的药物释放曲线并无明显差别。在损伤后1,2,3,4周各时间点用BBB评分法对大鼠运动功能进行评分,并应用免疫荧光和免疫组化观察轴突再生和瘢痕形成。结果证实,各实验组中轴突再生以及运动功能恢复均优于对照组；载有ChABC的材料组,瘢痕壁不连续,瘢痕疏松；单独缓释db-cAMP组和单独ChABC组在功能恢复方面无显著性差异；联合用药组的轴突再生以及运动功能恢复情况均好于单独给药组,组间BBB评分有显著性差异(p≤0.05)本研究的主要结论：1.可降解PPC电纺丝以及壳聚糖微球拥有很好的生物组织相容性以及局部缓释药物能力,并且可以通过调节电纺丝的直径、拉伸率、断裂伸长率和壳聚糖微球直径等物理特性调整其降解速度以达到优化药物缓释的目的。2.载有双丁酰环磷酸腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate, db-cAMP)的PPC电纺丝材料可以促进大鼠SCI后轴突再生、运动功能恢复、减少胶质瘢痕形成。3.载有硫酸软骨素酶ABC (ChABC)的壳聚糖微球复合PPC电纺丝材料可以很好地缓释ChABC,阻止空洞内瘢痕壁形成,使轴突更容易通过损伤区域,促进大鼠脊髓损伤后运动功能恢复。4.联合载ChABC 和 db-cAMP的电纺丝-微球材料与缓释单一药物材料相比进一步改善了SCI后大鼠的运动功能,使损伤区域残存神经纤维增多、胶质瘢痕与空洞接触面变得不规则,瘢痕减少。实验结果表明,PPC电纺丝和壳聚糖微球复合材料缓释载体可稳定地在脊髓损伤局部释放治疗药物,并且其降解和缓释药物的速度可调控。该复合材料可为神经系统局部缓释药物治疗提供良好的载体,并能为CNS损伤修复、抗肿瘤治疗及退行性疾病等领域的研究提供新的研究平台。本实验结果显示该复合材料缓释载体具有良好的临床应用前景。