第一部分肝癌差异表达miRNAs阵列分析及miR-138和miR-483-5p与肝癌发生机理的研究肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球肿瘤病人死亡的主要原因之一。肝癌5年生存率不足5％，肝癌病人确诊越晚，其预后效果越差。晚期诊断严重限制了肝癌治疗手段的选择，因此肝癌的早期发现非常重要，阐明肝癌发生机制将有助于寻找早期诊断肝癌的肿瘤标记物。MicroRNA(miRNA)是一类可调控基因表达的非编码RNA家族，能通过与mRNA分子相互作用导致RNA降解或阻遏蛋白质翻译。成熟的miRNA是一种约20-22nt长的单链RNA分子，可通过完全或不完全碱基配对与mRNA分子3’UTR相结合，从而抑制靶基因的翻译，参与细胞一系列的重要过程，包括细胞分化、细胞增殖与细胞凋亡。越来越多的研究表明肿瘤细胞与癌旁组织来源细胞间miRNA表达谱具有明显差异，miRNA表达谱可将肝癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌及白血病与临近正常组织分开。半数以上的miRNA定位于与肿瘤发生相关的染色体区域和脆性位点，提示miRNA在肿瘤形成过程中可能扮演着重要的角色。因此研究与肝癌发生、发展相关的miRNA表达谱的变化，探索肝癌发生发展的分子机制，这对肝癌的早期诊断和及时防治具有非常重要的意义。在本研究中通过检测临床肝癌标本与癌旁组织标本中miRNA的表达谱，对筛选出的差异表达miRNA，以定量RT-PCR和Western blotting分析其相对应靶蛋白的表达状况，探讨其在HCC发生发展中的作用机制。一、肝癌差异表达miRNAs阵列分析miRNA与肿瘤的发生密切相关，目前已经发现miRNA在许多肿瘤中差异表达，但miRNA在肝癌发生发展中的研究尚不多。本部分通过Taqman低密度miRNA阵列（Taqman low density miRNA array，TLDA）分析了3对肝癌癌组织与其癌旁组织中667种miRNA表达谱差异。应用Hierarchical Cluster软件将24种差异表达的miRNA进行聚类分析，利用Real time RT-PCR在另外18对肝癌癌组织中验证出了20种miRNA的差异表达，进一步对差异表达miRNA的靶蛋白进行预测，并分析其参与的细胞功能和信号通路，绘制miRNA-靶蛋白mRNA网络图。结果如下：在本实验中，Taqman低密度miRNA阵列检测结果显示24种miRNA在肝癌组织与非肝癌组织间呈现差异表达，每种miRNA表达数值均与U6表达值相比进行标化。其中11种miRNA在癌组织中相对于在癌旁组织中上调表达，13种miRNA在癌组织中下调表达。应用Hierarchical Cluster软件将24种差异表达miRNA进行聚类时，可基本将肝癌组织与毗邻癌旁组织分开。利用Realtime RT-PCR检测上述24种miRNA在另外18例肝癌病人癌组织与非癌组织中的表达情况，证实了10种上调表达的miRNA(miR-217, miR-518b, miR-517c, miR-520g, miR-519a, miR-522, miR-518e,miR-525-3p, miR-512-3p, and miR-518a-3p)和10种下调表达的miRNA(miR-138,miR-214, miR-214#, miR-27a#, miR-199a-5p, miR-433, miR-511, miR-592,miR-483-5p andmiR-483-3p)。预测上述差异表达miRNA的靶基因，并进行靶基因的功能分类（GO）和信号通路分析（KEGG Pathway)可知，signal transduction是这些miRNA调控的最重要的细胞功能，而regulation of actin skeleton和panthway in cancer是这些miRNA调控的最重要的信号通路。绘制miRNA与靶基因调控网络图，可以得知：miR-519a和miR-199a-5p可能是起到主导作用的miRNA，而RPS6KA3、SMAD4、ACVR2A等基因可能是与肝癌发生发展相关的重要基因。基于上述研究结果，选取miR-519a、miR-199a-5p、miR-138、miR-483-5p和miR-520g进一步深入研究。二、miR-138调控细胞周期蛋白D3（CCND3）引起G1期阻滞miR-138在肝组织中表达量较高，且在肝癌中呈现明显下调表达，推测miR-138与HCC的发生发展密切相关，但是它在HCC中的作用机制尚不清楚。本研究对miR-138调控靶基因及其在肿瘤发生中的功能研究进行更深入的研究。应用miRNA靶标预测软件TargetScan和miRnada预测miR-138靶基因。常规培养人肝癌细胞HepG2和Huh7，进行脂质体瞬时转染后，定量RT-PCR检测CCND3的表达量， Celltiter blue检测肝癌细胞活性，应用流式细胞技术检测细胞周期的改变，WesternBlotting用于检测CCND3蛋白水平的改变。结果如下：采用TargetScan和miRanda软件预测到CCND3为miR-138的靶基因。WesternBlotting结果显示，miR-138在肝癌中发生不同程度的下调，而CCND3是上调表达，两者呈负相关。在HepG2和Huh7细胞中转染miR-138模拟物，发现CCND3蛋白表达被下调，而转染miR-138抑制物，CCND3蛋白表达上调。外源表达miR-138抑制CCND3蛋白的表达，同时减弱了细胞的生长速度。与之相反的是，抑制细胞内miR-138表达则促进细胞的生长速度。应用流式细胞仪检miR-138对细胞周期及凋亡的影响，结果发现转染miR-138模拟物，细胞G0/Gl期延长，S期相应缩短；与之相反的是转染miR-138抑制物，细胞G0/Gl期缩短，S期相应延长。在裸鼠模型中，皮下注射转染miR-138模拟物或抑制物的HepG2细胞，连续观察5周，从第3周开始注射了转染miR-138模拟物HepG2细胞的肿瘤显著小于未转染HepG2对照组，而注射了转染miR-138抑制物HepG2细胞的肿瘤显著大于未转染HepG2对照组，此动物体内的肿瘤抑制实验再次验证了miR-138的抑制肿瘤细胞生长的作用。三、miR-483-5p调控的维甲酸诱导蛋白16（RAI16）是一种新的癌蛋白和肝癌标志物miR-483-5p在肝癌中呈现明显下调表达，推测miR-483-5p与HCC的发生发展密切相关，但是它在HCC中的作用机制尚不清楚。本研究对miR-483-5p调控靶基因及其在肿瘤发生中的功能研究进行更深入的研究。应用miRNA靶标预测软件TargetScan和miRnada预测miR-483-5p靶基因。常规培养人肝癌细胞HepG2和Huh7，进行脂质体瞬时转染后，定量RT-PCR检测CCND3的表达量， Cell titer blue检测肝癌细胞活性，应用流式细胞技术检测细胞周期的改变，Western Blotting用于检测RAI16蛋白水平的改变。结果如下：采用TargetScan和miRanda软件预测到RAI16为miR-483-5p的靶蛋白。WesternBlotting结果显示，miR-483-5p在肝癌中发生不同程度的下调，而RAI16是上调表达，两者呈负相关。在HepG2和Huh7细胞中转染miR-483-5p模拟物，发现RAI16蛋白表达被下调，而转染miR-483-5p抑制物，RAI16蛋白表达上调。外源表达miR-483-5p抑制RAI16蛋白的表达，同时减弱了细胞的生长速度。与之相反的是，抑制细胞内miR-483-5p表达则促进细胞的生长速度。应用流式细胞仪检miR-483-5p对细胞周期及凋亡的影响，结果发现转染miR-483-5p模拟物，细胞G0/Gl期延长，S期相应缩短；与之相反的是转染miR-483-5p抑制物，细胞G0/Gl期缩短，S期相应延长。在裸鼠模型中，皮下注射转染pcDNA3.1-RAI16或siRNA-RAI16的HepG2细胞，连续观察5周，从第3周开始注射了转染pcDNA3.1-RAI16HepG2细胞的肿瘤显著大于未转染HepG2对照组，而注射了转染siRNA-RAI16HepG2细胞的肿瘤显著小于未转染HepG2对照组，此动物体内的肿瘤抑制实验再次验证了RAI16的促进瘤细胞生长的作用。四、结论本研究在配对肝癌样本中筛选出20个差异表达miRNA，包括10个上调的miRNA和10个下调的miRNA。上述差异表达miRNA的靶基因的功能分类（GO）和信号通路（KEGG Pathway)分析可知，signal transduction是这些miRNA调控的最重要的细胞功能，而regulation of actin skeleton和panthway in cancer是这些miRNA调控的最重要的信号通路。而miR-519a、miR-199a-5p、miR-138、miR-483-5p和miR-520g在这些差异表达miRNAs中起主导作用，值得进一步深入研究。对miR-138深入的研究表明：miR-138调控CCND3的表达，诱导细胞周期在G0/Gl期停滞，进而抑制肝癌细胞的生长。在HCC组织中，miR-138下调表达，减弱了对CCND3的调控，CCND3呈上调表达，失去对细胞周期控制，肿瘤细胞生长速度加快。综上说明miR-138在HCC的发生发展中发挥抑癌基因的作用，这将为HCC的诊断与治疗带来新的曙光。对miR-483-5p及其靶蛋白RAI16的深入研究表明：miR-483-5p调控RAI16的表达，诱导细胞周期在G0/Gl期停滞，进而抑制肝癌细胞的生长。在HCC组织中，miR-483-5p下调表达，减弱了对RAI16的调控，RAI16呈上调表达，失去对细胞周期控制，肿瘤细胞生长速度加快。综上说明miR-483-5p和RAI16在HCC的发生发展中发挥重要作用，这深入对HCC致病机理的认识提供新的思路。第二部分HBx诱发anti-URGs用于肝硬化肝癌高危人群预警的实验研究肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是目前最为常见的癌症之一。在我国，肝癌的发病率高与乙型肝炎病毒（HBV）慢性感染密不可分，相当一部分的慢性乙肝迁延不愈，并经肝纤维化、肝硬化进程向肝癌转化。但对慢乙肝发生和转归的分子机制认知严重不足，缺少有效的早期诊断和干预、治疗手段，难以阻断大量病患从慢性肝炎向肝硬化和肝癌发展。目前，甲胎蛋白（AFP）用于诊断HCC已被广泛认可，但实属无奈之选。越来越多的文献报道了AFP在诊断和监测HCC的局限性。事实上，按照目前的HCC诊断标准，当AFP和影像学检查出现异常时，肝癌往往已发展到晚期，多数患者已失去了宝贵的早期干预治疗的机会。此外，有3个最有可能用于HCC辅助诊断的标志物：AFP的异构体(AFP-L3%)、人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）及去γ羟基凝血素(DCP)。其他已报道的标志物还有肝癌癌蛋白p28GANK、高尔基磷蛋白(GOLPH2/GP73)、鳞状上皮细胞癌抗原(SCCA)、α-L-岩藻糖苷酶(AFU)和肝细胞生长因子(HGF)等，但上述潜力标志物，即使联合应用，对于HCC诊断的敏感度仍不能达到作为理想标志物的标准。因此，探究肝炎发展为肝癌的致病机制，寻找理想的肝癌标志物，最终实现阻断或减缓肝炎向肝硬化肝癌转化，降低肝癌的发病率和死亡率，仍需不懈的努力。课题组前期工作发现了5种HBx诱导的高表达蛋白(URG4, URG7, URG11,URG12和Sui1)，URG4和URG11是癌基因，能够促进肿瘤生长；URG7具有抵抗Fas介导细胞凋亡的作用；URG12是核糖体蛋白，而Sui1是转录启始因子，两者对于蛋白翻译的完整性非常重要。这5种高表达蛋白都具有刺激肝细胞生长和抵抗TNF作用的特性，其抗体与肝炎发展至肝癌的进程密切相关，上述蛋白的抗体（anti-URGs）是否可作为肝癌标志物，监测肝炎发展为肝硬化、肝癌的进程，用于HCC的早期诊断和高危人群的筛查值得进一步研究。一、合成多肽抗原检测anti-URGs ELISA方法的建立针对5种URGs的蛋白序列，设计并合成14-22氨基酸长度的多肽作为包被抗原，建立检测血清中anti-URGs抗体的间接ELISA方法。在包被液、多肽抗原包被浓度、封闭剂、封闭时间、血清稀释度、血清反应时间和显色时间方面对检测方法进行优化，确定Cut-off值，并评估检测方法的敏感性、特异性、精确性和稳定性。结果如下：1、建立了合成多肽抗原检测anti-URGs的ELISA方法，检测流程为：多肽抗原以10ug/ml的浓度用pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃包被过夜，含3%BSA的Tris缓冲液37℃封闭2小时以上，按照1：10稀释加入血清4℃过夜，充分洗涤后加入HRP标记山羊抗人IgG,37℃孵育30分钟，充分洗涤后加入TMB，避光显色10分钟，2M硫酸终止反应后测OD值。2、确定了ELISA检测anti-URG4、anti-URG7、anti-URG11、anti-URG12和anti-Sui1的Cut-off值分别为：0.103、0.098、0.101、0.107和0.113。3、ELISA方法具有较好的敏感性（稀释倍数20-640倍）和特异性（多肽抗原可阻断76.9-89.6%的反应），检测试剂批内差3.2-4.5%，批间差7.4-10.3%，在4℃可保存至少5个月。二、anti-URGs在乙型肝炎发展为肝癌进程中预警作用的研究采用自行建立的多肽抗原检测anti-URGs的ELISA方法，大规模检测肝炎、肝硬化和肝癌患者血清中的5种anti-URGs，进行了下列研究：1、anti-URGs与肝炎发展为肝癌进程的相关性研究：检测全部血清样本中5种anti-URGs，OD值大于或等于Cut off值的判定为阳性，反之为阴性。利用统计学分析软件对实验数据进行分析，确定anti-URGs阳性数在健康献血员组、肝炎组、肝硬化组和肝癌组之间是否有统计学差异，即anti-URGs与肝炎发展为肝硬化、肝癌进展是否相关，并进一步评估anti-URGs用于HCC高危人群的筛查与小肝癌的早期诊断的可靠性。2、anti-URGs检查与AFP及其他标志物的对照研究：在肝炎、肝硬化、肝癌患者组中，对比anti-URGs检查与现有的AFP结合影像学检查的敏感度、特异度、阳性率和符合率。单独使用anti-URGs及其他已报道的标志物，包括AFP-L3%、GPC3和GP73等，对比其敏感度、特异度、阳性率和符合率；以多种方式联合使用anti-URGs及其他已报道的标志物，是否可提高检测的敏感度、特异度、阳性率和符合率。3、anti-URGs对于原发性肝癌发生、复发等的前瞻性研究：A在乙肝肝炎患者组中，追踪anti-URGs的动态变化，对比3种以上（包括3种）anti-URGs阳性和3种以下anti-URGs阳性的患者病情发展、转归的差异；B在肝硬化、肝癌患者组中，追踪治疗前后anti-URGs的变化，对比anti-URGs持续阳性和anti-URGs转阴的患者癌症复发及生存时间的差异。4、anti-URGs对于肝癌高危人群筛查的前瞻性研究：在乙肝病毒携带者与慢乙肝患者组中，对比3种或3种以上anti-URGs阳性、2种anti-URGs阳性、1种anti-URGs阳性和anti-URGs阳性全阴性的患者病情发展的差异。结果如下：1、发现全部558份患者血清和108份健康献血员血清中anti-URGs阳性个数在HBV相关的肝炎、肝硬化、肝癌及健康献血员组中有明显差异（P<0.001），在健康献血员组，91.7%小于等于1个anti-URGs阳性，在HBV相关的肝炎、肝硬化、肝癌组中，大于等于3个anti-URGs阳性的比例分别为：35.8%、60.7%和55.2%，此结果提示anti-URGs与肝炎发展为肝癌进程相关。2、按照在5种anti-URGs中有3个或3个以上阳性则判定为anti-URGs阳性的标准，在肝硬化和肝癌患者中检测敏感度为58.3%，在健康献血员中的特异度为99.1%，在HBV感染无症状携带者中的特异度为87.7%，在其他癌症患者中的特异度为90.0%。3、为全面评价anti-URGs作为肝硬化肝癌高危人群预警的肿瘤标志物的可靠性，本研究还同时检测了血清中的AFP、AFP-L3%、GPC3和GP73含量。在HBV相关肝硬化和肝癌组中，anti-URGs的敏感度为60.0%和53.3%；AFP的敏感度为33.3%和30.0%； AFP-L3%的敏感度为40.0%和33.3%；GPC3的敏感度为36.3%和23.3%；GP73的敏感度为53.3%和33.3%；在健康献血员组中, anti-URGs的特异度为100%，AFP、AFP-L3%、GPC3、GP73的特异度分别为93.4%，96.7%，93.4%和93.4%。将anti-URGs分别与AFP、AFP-L3%、GPC3和GP73联合检测，可部分提高敏感度，在肝硬化组为76.6%，73.3%，73.3%和76.6%，在肝癌组为60.3%，60.3%，60.0%和60.0%。4、对10例肝硬化患者的进一步追踪研究显示anti-URGs阳性的肝硬化患者24个月内发生肝癌的几率大幅升高（anti-URGs阳性组：6/10人，anti-URGs阴性组：1/10人），提示anti-URGs与肝硬化肝癌发生的风险性相关，anti-URGs阳性的患者应给予适当的预防性治疗及定期随访。5、对于10例HBV相关肝癌患者治疗前后系列血清中anti-URGs进行检测发现，anti-URGs在肝癌临床诊断前即可出现，在治疗后发生转阴，而在个别癌症复发的患者血清中持续阳性。三、结论本课题建立了多肽抗原检测anti-URGs的ELISA方法，并对HBV相关急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌患者血清，其他癌症患者、HCV肝炎肝硬化患者以及健康献血员血清进行规模化检测，结果显示：anti-URGs在HBV相关的肝炎、肝硬化、肝癌组中的检出率分别为21.7%、60.2%和55.1%，存在明显统计学差异（P<0.001），anti-URGs的确与HBV相关的肝炎、肝硬化和肝癌的病情发展相关，anti-URGs在肝硬化和肝癌患者中检测敏感度为58.3%，在健康献血员中的特异度为99.1%。因此，anti-URGs可以作为肝硬化、肝癌高危人群预警的血清标志物。本课题研究的创新点在于：（1）本课题首次将anti-URGs作为监测肝炎发展为肝癌进程的血清标志物，具有较好的敏感度和特异度，具有先进性。（2）anti-URGs与肝癌发展的多个方面相关，采用anti-URGs与AFP、AFP-L3%或GP73等组合检测时可提高检测敏感度15%。（3）本课题着眼于HBV感染后病情由肝炎发展为肝硬化、肝癌的整个进程的监测以及相应的肝硬化、肝癌高危人群预警的血清标志物的筛选和评估。在肝炎和肝硬化阶段血清中即已出现3个或3个以上anti-URGs阳性的患者，具有发展成为肝癌患者的高风险性，应例行血清学和影像学检查，尽早进行干预和有效的治疗。本课题的完成将有助于原发性肝癌的预警、诊断和预后，阻断肝炎病患向肝硬化肝癌转化，降低肝癌的发病率和死亡率。