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白斑综合征病毒（Whitespotsyndromevirus，WSSV）是目前制约对虾养殖业健康可持续发展的主要病原之一。迄今为止，对虾养殖中仍缺乏防治该病毒的有效方法。究其原因，主要与人们对WSSV感染和致病的分子机制缺乏足够了解有关。近年来研究发现，WSSV极早期蛋白IE1可与对虾蛋白相互作用而参与对病毒感染的调节。然而，人们目前对IE1与对虾蛋白相互作用网络尚缺乏全面了解。为此，本研究以鉴定IE1相结合的对虾蛋白为切入点，探究IE1与对虾蛋白的相互作用网络，研究IE1在病毒感染中的功能和作用机制，以揭示病毒侵染和致病的分子机制，所获主要研究结果如下：
1、IE1与对虾蛋白相互作用网络研究
首先，采用基因克隆、原核表达、GST-pulldown和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等技术，在获得融合蛋白GST-IE1的基础之上，鉴定凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血细胞中与IE1相结合的蛋白。结果发现，361个对虾血细胞蛋白可能与IE1发生结合。
其次，将上述IE1潜在互作蛋白进行Geneontology（GO）注释分析。结果显示，361个蛋白中264个蛋白具有GO注释。其中，参与细胞过程和代谢过程的蛋白最多，与响应刺激、信号通路和免疫系统过程等相关的蛋白分别为69、35和13个。
继而，将上述IE1潜在互作蛋白进行KEGG通路注释分析。结果发现，所鉴定到的互作蛋白中有59个具有KEGG通路注释，主要与Focaladhesion（如Src64B、PI3Kα和PI3Kβ等）、Phagosome（如Integrinα-5和Calnexin等）、VEGF（如Paxillin1和COX等）等15条信号通路有关。
最后，结合上述KEGG通路注释结果和已报道结果，对IE1与对虾蛋白的相互作用网络进行预测。结果发现，IE1可能与对虾16条信号通路中的62个蛋白发生相互作用。
2、IE1与对虾Src64B相互作用研究
在上述结果中，我们发现，IE1潜在互作蛋白在Focaladhesion信号通路中注释最多，提示IE1可能参与调控Focaladhesion信号通路。为此，我们选取该通路中的关键蛋白Src64B激酶进行进一步研究。
首先，在本课题组凡纳滨对虾转录组数据中发现了两条Src64B序列与质谱数据相匹配，提示可能为Src64B的两个亚型（命名为LvSrc64B1和LvSrc64B2）。通过设计特异性引物，我们分别扩增获得它们的全长开放阅读框序列。序列分析发现，LvSrc64B1全长1590bp，编码529个氨基酸，LvSrc64B2全长为1578bp，编码525个氨基酸；结构域预测分析发现，LvSrc64B1和LvSrc64B2均具有Src家族的典型结构域，包括1个Src同源序列3（SH3）、1个Src同源序列2（SH2）以及1个酪氨酸激酶域（TyrKc）；序列比对分析显示，LvSrc64B1与LvSrc64B2氨基酸的同源性为92.8%，其差异序列主要出现在C端区域，且与人（Homosapiens）Src和果蝇（Drosophilamelanogaster）Src64B序列高度同源；进化树分析显示，LvSrc64B1和LvSrc64B2与其它无脊椎动物Src64B聚成一簇。
其次，原核表达、纯化His-LvSrc64B1和His-LvSrc64B2融合蛋白，并通过GST-pulldown和Westernblot等技术分析His-LvSrc64B1、His-LvSrc64B2与GST-IE1之间的相互作用。结果显示，LvSrc64B1和LvSrc64B2确实均可以与GST-IE1发生特异性结合。
最后，生物信息学分析发现，IE1C端存在两个潜在的Src激酶结合基序（Y196PGP和Y202VIE）。位点突变实验证实，IE1Y196PGP基序中Y196位点可能是介导IE1与LvSrc64B相互作用的关键位点。
3、IE1与对虾Src64B相互作用对病毒感染的调控研究
首先，采用实时定量PCR（qPCR）和WSSV胁迫等策略分析LvSrc64B1、LvSrc64B2与ie1在病毒感染后转录水平的相关性。结果发现，在WSSV胁迫下，LvSrc64B1和LvSrc64B2均能响应WSSV胁迫，且与ie1基因表达模式相近，均在病毒刺激后表达上调，呈正相关关系。
其次，采用RNA干扰、WSSV胁迫等技术探究LvSrc64B敲降后ie1转录水平的变化情况。结果显示，与对照组相比，在LvSrc64B敲降后、病毒刺激12h时，ie1mRNA表达量显著下调，具有极显著性差异（p<0.01）。由此推测，IE1可通过结合LvSrc64B促进其自身基因ie1的转录和WSSV对宿主的感染。
综上所述，本研究首次发现WSSV极早期蛋白IE1可能与凡纳滨对虾Focaladhesion等15条信号通路中的59个蛋白存在相互作用，尤其是IE1Y196位点可能通过结合LvSrc64B1和LvSrc64B2促进其自身基因ie1的转录和WSSV对宿主的感染。所获研究结果为揭示病毒与宿主相互作用网络奠定了良好的基础。同时，有助于寻找预防与治疗病毒的潜在靶点，为设计和开发新的抗病毒药物提供新的思路。
1、IE1与对虾蛋白相互作用网络研究
首先，采用基因克隆、原核表达、GST-pulldown和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等技术，在获得融合蛋白GST-IE1的基础之上，鉴定凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）血细胞中与IE1相结合的蛋白。结果发现，361个对虾血细胞蛋白可能与IE1发生结合。
其次，将上述IE1潜在互作蛋白进行Geneontology（GO）注释分析。结果显示，361个蛋白中264个蛋白具有GO注释。其中，参与细胞过程和代谢过程的蛋白最多，与响应刺激、信号通路和免疫系统过程等相关的蛋白分别为69、35和13个。
继而，将上述IE1潜在互作蛋白进行KEGG通路注释分析。结果发现，所鉴定到的互作蛋白中有59个具有KEGG通路注释，主要与Focaladhesion（如Src64B、PI3Kα和PI3Kβ等）、Phagosome（如Integrinα-5和Calnexin等）、VEGF（如Paxillin1和COX等）等15条信号通路有关。
最后，结合上述KEGG通路注释结果和已报道结果，对IE1与对虾蛋白的相互作用网络进行预测。结果发现，IE1可能与对虾16条信号通路中的62个蛋白发生相互作用。
2、IE1与对虾Src64B相互作用研究
在上述结果中，我们发现，IE1潜在互作蛋白在Focaladhesion信号通路中注释最多，提示IE1可能参与调控Focaladhesion信号通路。为此，我们选取该通路中的关键蛋白Src64B激酶进行进一步研究。
首先，在本课题组凡纳滨对虾转录组数据中发现了两条Src64B序列与质谱数据相匹配，提示可能为Src64B的两个亚型（命名为LvSrc64B1和LvSrc64B2）。通过设计特异性引物，我们分别扩增获得它们的全长开放阅读框序列。序列分析发现，LvSrc64B1全长1590bp，编码529个氨基酸，LvSrc64B2全长为1578bp，编码525个氨基酸；结构域预测分析发现，LvSrc64B1和LvSrc64B2均具有Src家族的典型结构域，包括1个Src同源序列3（SH3）、1个Src同源序列2（SH2）以及1个酪氨酸激酶域（TyrKc）；序列比对分析显示，LvSrc64B1与LvSrc64B2氨基酸的同源性为92.8%，其差异序列主要出现在C端区域，且与人（Homosapiens）Src和果蝇（Drosophilamelanogaster）Src64B序列高度同源；进化树分析显示，LvSrc64B1和LvSrc64B2与其它无脊椎动物Src64B聚成一簇。
其次，原核表达、纯化His-LvSrc64B1和His-LvSrc64B2融合蛋白，并通过GST-pulldown和Westernblot等技术分析His-LvSrc64B1、His-LvSrc64B2与GST-IE1之间的相互作用。结果显示，LvSrc64B1和LvSrc64B2确实均可以与GST-IE1发生特异性结合。
最后，生物信息学分析发现，IE1C端存在两个潜在的Src激酶结合基序（Y196PGP和Y202VIE）。位点突变实验证实，IE1Y196PGP基序中Y196位点可能是介导IE1与LvSrc64B相互作用的关键位点。
3、IE1与对虾Src64B相互作用对病毒感染的调控研究
首先，采用实时定量PCR（qPCR）和WSSV胁迫等策略分析LvSrc64B1、LvSrc64B2与ie1在病毒感染后转录水平的相关性。结果发现，在WSSV胁迫下，LvSrc64B1和LvSrc64B2均能响应WSSV胁迫，且与ie1基因表达模式相近，均在病毒刺激后表达上调，呈正相关关系。
其次，采用RNA干扰、WSSV胁迫等技术探究LvSrc64B敲降后ie1转录水平的变化情况。结果显示，与对照组相比，在LvSrc64B敲降后、病毒刺激12h时，ie1mRNA表达量显著下调，具有极显著性差异（p<0.01）。由此推测，IE1可通过结合LvSrc64B促进其自身基因ie1的转录和WSSV对宿主的感染。
综上所述，本研究首次发现WSSV极早期蛋白IE1可能与凡纳滨对虾Focaladhesion等15条信号通路中的59个蛋白存在相互作用，尤其是IE1Y196位点可能通过结合LvSrc64B1和LvSrc64B2促进其自身基因ie1的转录和WSSV对宿主的感染。所获研究结果为揭示病毒与宿主相互作用网络奠定了良好的基础。同时，有助于寻找预防与治疗病毒的潜在靶点，为设计和开发新的抗病毒药物提供新的思路。