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背景近年来,嵌合抗原受体（CAR）修饰免疫细胞疗法在恶性肿瘤的治疗中展现出不错的疗效,但也表现出多种副作用,安全性和有效性是其在临床应用中面临的两大问题。通过模块化设计将肿瘤抗原识别域从CAR中分离出来,构建通用型CAR是免疫细胞治疗的重大突破,此外,CAR修饰自然杀伤（NK）细胞显示出同种异体应用的潜力。结合合成生物学工程化理念,本课题提出利用化学诱导二聚化（CID）元件构建通用型CAR并修饰NK92细胞,以期能够使用通用型CAR-NK92细胞治疗各类肿瘤患者。目的基于合成生物学工程化理念,利用化学诱导二聚化元件构建可由开关分子调控的通用型嵌合抗原受体（CAR）,并对同种异体应用安全的NK92细胞进行工程化改造,最终构建一种安全有效的通用型CAR-NK92细胞。方法基于化学诱导二聚化元件FKBP12的突变体FKBP12F36V（下文简称m FKBP）和FRB的突变体FRBT2098L（下文简称m FRB）,将其分别与CAR元件组合,即m FRB作为CAR胞外域,m FKBP与抗体组成融合蛋白,从而构建由小分子雷帕霉素（RAPA）介导m FKBP-m FRB二聚化而形成完整结构的CAR分子。一方面通过全基因合成技术获得分子模块m FRB-CAR,经酶切连接技术将其构建到慢病毒载体上,通过慢病毒稳定转染和嘌呤霉素富集后获得高表达目的模块m FRB-CAR的NK92细胞株,即m FRB-CAR-NK92。通过流式细胞术检测m FRB-CAR的表达及细胞表型,CCK-8检测m FRB-CAR-NK92的增殖情况。另一方面利用不同抗原靶点的相应抗体,全基因合成后与元件m FKBP一起构建到蛋白表达载体p ET28a,通过大肠杆菌进行蛋白表达后纯化浓缩得到抗体蛋白。将获得的蛋白抗体、RAPA与m FRB-CAR-NK92联用,通过乳酸脱氢酶法（LDH）比较NK92、p CDH-NK92和m FRB-CAR-NK92对肿瘤细胞的杀伤效果,使用ELISA检测细胞因子的释放。结果1.基于化学诱导二聚化元件m FKBP与m FRB,通过蛋白质结构建模技术成功设计出CID（m FRB）-CAR以及m FKBP-纳米抗体融合蛋白（m FKBP-La G16）。2.构建m FRB-CAR表达载体并制备表达m FRB-CAR的NK92细胞。3.构建m FKBP-La G16蛋白表达载体并获得纯度较高的目的蛋白。4.通过细胞毒性试验以及细胞因子检测试验,在联合蛋白与小分子药物的前提下,相较于NK92细胞、p CDH-NK92细胞,CID（m FRB）-CAR-NK92细胞能有效识别并作用于靶细胞,并且其颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ、TNF-α的表达均显著提高。结论本研究运用合成生物学工程化理念,基于化学诱导二聚化元件成功设计通用型CID（m FRB）-CAR系统,即CID（m FRB）-CAR以及m FKBP-纳米抗体融合蛋白。通过细胞毒性实验以及细胞因子检测验证m FRB-CAR-NK92细胞联合m FKBP-sc Fv并在小分子药物雷帕霉素的诱导下对表达相应靶点的肿瘤细胞表现出显著的和可调控的体外杀伤活性。