菊三七Gynura japonica(Thunb.) Juel.是一种民间用中草药。为菊科菊三七属植物，又名土三七，三七草，菊叶三七，血当归，牛头三七。药用部位为干燥根。性味，甘苦，温。功效破血散瘀，止血，消肿。主要用于治疗治跌打损伤，创伤出血，吐血，产后血气痛等症。国内主要分布于中国产四川、广西、安徽、云南、江西等地，国外主要分布于尼泊尔、泰国和日本等地[1]。　　目前对菊三七的研究并不深入，并且对其毒性的研究也十分有限。近年来临床上由于误服用菊三七而导致肝窦阻塞综合征(hepatic sinusoidal obstructionsyndrome，HSOS)的报道急剧增加，并且受到广泛关注。　　肝窦阻塞综合征又称肝小静脉闭塞病(hepatic veno-occlusive disease，HVOD)。HSOS的主要临床表现为:肝区疼痛、肿大、出现腹水、黄疸以及高胆红素(total bilirubin，TBIL)等[2]。在我国，服用含有吡咯里西啶生物碱(pyrro lizidine alkaloids，PAs)的植物或药物，如菊三七，是诱发HSOS的主要原因[3-6]。HSOS致病机制复杂，目前尚不明确。同时对于HSOS的保护与治疗，现代研究难以给出满意答案。因此急需阐明该疾病的发病机制，并提出治疗该疾病的有效药物及手段。　　由于肝脏纤维化以及炎症与HSOS病程的发展密切相关，所以本研究从肝脏纤维化及炎症的角度，结合分子生物学技术探讨HSOS的致病机理。本课题组前期长期致力于胆宁片对ANIT及胆管结扎造成的胆汁淤积模型的保护作用研究，发现胆宁片通过减弱肝脏的炎症反应从而达到保肝的作用[7]。还有文献表明，胆宁片对D-氨基半乳糖和四氯化碳引起的肝损伤及肝纤维化有明显的保护作用。而炎症及纤维化是HSOS的两个明显病理特征，所以我们选取胆宁片作为HSOS的各选保护药物，并从肝纤维化和炎症角度，在分子生物学水平上探究胆宁片对HSOS的保护机制。　　1.HSOS的致病机制研究　　(1)通过连续给予小鼠菊三七醇提物40天，建立肝窦阻塞综合征动物模型。并结合血清生化指标，病理切片，电镜图像，免疫组化切片，HSOS等多种途径对该模型进行评价。血清生化指标及病理切片提示该模型造成了严重的肝脏损伤，上述损伤通过HSOS评分得以量化，该结果亦显示菊三七造成了与HSOS临床相似的病理损伤。MMP9免疫组化检测及电镜图像结果显示肝窦内皮细胞(hepatic sinusoidal endothelial cells，HSEC)受损并出现脱落。以上实验结果与HSOS相关研究及临床表征相似，证明我们所建立动物模型为典型的HSOS模型，为该疾病的机制研究打下坚实基础　　(2)运用酶联免疫吸附测定方法(enzyme-linked immuno sorbent assay，Elisa)、蛋白印迹法(Western Blot，WB)、胶原阳性率分析、荧光定量PCR(reversetranscription-polymerase chain reaction，QPCR)等多种分析方法对HSOS中的肝脏纤维化进行全面系统评价。上述实验数据显示经菊三七醇提物造模后，小鼠肝脏内胶原合成的相关因子表达明显升高，细胞膜外基质(extracellularmatrix，ECM)相关基因表达异常。提示肝细胞胶原分泌量显著增加，ECM因其合成降解平衡紊乱而堆积，从而造成模型小鼠肝脏中出现明显的纤维化。以上研究证实在HSOS模型小鼠上发生了明显的纤维化，为之后纤维化相关信号通路研究打下坚实基础。　　(3)运用Elisa、Western Blot、QPCR等多种分子生物学分析方法探究HSOS中纤维化的形成机制。结果显示，模型小鼠血清中转化生长因子-β(transforminggrowth factor-β，TGF-β)分泌量显著增加，肝脏中smad3发生磷酸化，从而进入细胞核诱导胶原coliagenⅠα1和coliagenⅠα2基因表达。提示TGF-β/Psmad3信号通路的激活是导致HSOS模型小鼠纤维化的主要原因之一。为肝窦阻塞综合征的临床研究及治疗提供新的思路。　　(4)运用QPCR分析方法，从分子生物学水平评价HSOS模型中产生的炎症。结果表明，炎症相关因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，tnf-α),白介素-1β及白介素-6(interleukin-1β,il-1β; interleukin-6，il-6)基因表达明显上调，炎症伴随HSOS病程发展。以上结果为后续对于肝窦阻塞综合征的保护及治疗研究奠定理论基础。　　2.胆宁片对于HSOS的保护作用及其保护机制研究　　(1)给予小鼠菊三七醇提物的同时，给药小鼠胆宁片，从而研究胆宁片对于HSOS的保护作用。结合血清生化指标，病理切片，电镜图像，免疫组化切片，HSOS评分等多种途径对上述保护作用进行评价。血清生化指标及病理切片显示胆宁片可以有效缓解该模型造成的肝脏损伤，该保护作用通过HSOS评分得以量化。免疫组化检测结果显示，胆宁片保护组中基质金属蛋白酶9(MMP9)的表达显著下降，提示胆宁片可以减轻造模造成的肝窦内皮细胞(HSEC)损伤。由此，我们首次提出胆宁片对于HSOS有一定程度的保护作用。且胆宁片为已经上市的中成药，未有明显毒副作用报道[7]，故有望成为肝窦阻塞综合征的各选保护治疗药物。　　(2)运用Elisa、胶原阳性率分析、免疫组化、QPCR等多种分析系统评价胆宁片对于HSOS中的肝脏纤维化的保护作用，并探讨其作用机制。实验数据显示胆宁片能有效抑制小鼠肝脏中胶原合成，并可调节ECM体内生成与代谢平衡，从而抑制HSOS中的肝脏纤维化的发生。该过程可能与抑制TGF-β/Psmad3信号通路有关。本实验首次提出胆宁片可以在一定程度上缓解HSOS中产生的纤维化，并且该过程可能与抑制TGF-β/Psmad3信号通路有关。以上结论对于HSOS的保护以及保护机制研究具有重要意义。　　(3)运用QPCR分析方法，从分子生物学水平评价胆宁片对于HSOS模型中产生的炎症的保护作用。结果表明，胆宁片保护组小鼠炎症相关因子tnf-α，il-1β基因表达较HSOS模型组有不同程度的回调，说明胆宁片可以一定程度上抑制HSOS中炎症的发生。从而为HSOS的保护及治疗提供理论参考。　　综上，本研究从肝纤维化及炎症角度阐释了HSOS的致病机制，首次探讨了胆宁片对于HSOS的保护作用，并首次从肝纤维化和炎症两方面探讨其保护作用机制。对于HSOS的理论研究及临床保护及治疗具有重要的意义。