西瓜花叶病毒(WMV)是马铃薯Y病毒属成员,由蚜虫以非持久性方式传播,广泛分布于世界各地,主要危害西瓜和甜瓜,引起花叶病。近几年该病害发生严重,已经成为制约西瓜和甜瓜高产稳产最主要的因素之一。本文完成了我国西瓜花叶病毒的基因组全序列的测定,在此基础上,克隆和体外表达了蚜传因子HC-Pro和CP蛋白,制备了相应抗体,利用Far western blot技术鉴定了其蚜虫体内的受体蛋白,并对三者互作关系进行研究,进一步阐明了非持久性传毒的分子机制。研究结果如下:1.利用RT-PCR和5′-和3′-RACE技术,克隆了西瓜花叶病毒基因组编码区和非编码区,经序列拼接,得到了WMV RNA的全长cDNA,GenBank登录号为DQ399708,命名为中国株系(WMV-CHN)。分析发现,WMV具有单链正义RNA基因组,全长为10037个核苷酸,具有单一的开放阅读框(ORF),5′-末端和3′-末端各有一段非翻译区(UTR),3′-末端具poly(A)尾序。ORF长9651个核苷酸,起始于密码子AUG位于第133～135位核苷酸,终止密码子UAA位于第9784~9786位,编码一个由3217个氨基酸组成的分子量为365.8kD的多聚蛋白。根据计算机分析,确定了WMV基因组的结构和相关保守基序。5′- UTR长132个核苷酸,富含A而少G(A占46.3%,G仅占6.1%),3′-UTR长254个核苷酸,富含T少C(T占近40%,而C仅占13%)。编码的多聚蛋白经自编码的蛋白酶裂解后可形成10个成熟蛋白,从N-端到C-端分别为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP。WMV-CHN与法国株系(WMV-Fr)基因组同源性比较发现,整个基因组除3’-UTR比法国株系多2个核苷酸,其他区域数目相等。整个基因组核苷酸同源性为92.5%,多聚肽为92.4%,不同成熟蛋白之间核苷酸和氨基酸同源性分别为87.5%-96.8%和90.1%-100%,NIa-VPg核苷酸差异最大。把WMV-CHN的CP和其他国家的WMV CP核苷酸和氨基酸进行比对和同源性分析,结果发现与各个国家CP核苷酸和氨基酸同源性分别为93.0%～95.0%和96.5%～98.6%。与其他Potyvirus属成员相比,同源性最高的是大豆花叶病毒(SMV),核苷酸和氨基酸同源性分别为78.4%和86.1%,其他依次是花生条纹病毒病毒(PStV)、菜豆普通花叶坏死病毒(BCMNV)、菜豆普通花叶病毒(BCMV)、黑眼豇豆花叶病毒(BCoMV)和小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV),核苷酸和氨基酸同源性分别为68.3%和70.9%,67.2%和71.2%,67.3%和70.3%,67.7%和70.9%,62.2%和62.9%。WMV的N末端与病毒进化密切相关,分析发现WMV-CHN的5’-UTR与近源的SMV、BCMV和PStV碱基数目相同,在N端有约50bp的保守区段。WMV P1蛋白N端的氨基酸与2个BCMV和3个PStV P1蛋白N端同源性较高,而C端与SMV同源性较高,WMV可能是BCMV或PStV与SMV种间重组的结果。2.将WMV CP基因定向插入EcoRI/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WCP,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导2-8h后,成功表达了分子量约为37kD的CP蛋白。通过不同时间诱导发现,加入IPTG 4h后蛋白开始表达,8h后表达量比较大。以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV CP抗血清,ELISA法测其效价为1/6400,Western blot分析能与CP发生血清学反应。3.将WMV HC-Pro基因定向插入EcoRI/Sal I切开的pET30a中,构建了原核表达载体pET30-WHC,转化大肠杆菌BL21。经IPTG诱导2-8h后,成功表达了分子量约为57kD的HC-Pro蛋白。通过不同时间诱导发现,加入IPTG 2h后蛋白就开始表达,继续诱导到8h后表达量变化不大。以诱导的蛋白为抗原免疫家兔,制备了WMV HC-Pro抗血清,ELISA法测其效价为1/6400,Western blot分析能与HC-Pro发生血清学反应。4.将WMV HC-Pro基因定向插入EcoR I/Not I切开的pPIC9K中,构建了真核表达载体pPIC9K-WHC,经SalI单酶切后电转化Pichia pastoris GS115菌株,获得Mut+/His+表型高拷贝转化子。经1%甲醇诱导5d后,成功表达了分子量约为66kD的HC-Pro分泌蛋白。Western blot鉴定表明,表达蛋白可以和原核表达的HC-Pro蛋白的抗血清发生发生血清学反应,为筛选蚜虫体内传毒蛋白提供了基础。5.通过Far western blot技术,用HC-Pro蛋白做诱饵,在WMV传播介体桃蚜体内全蛋白中筛选出6种不同分子量蛋白,大小分别约86kD、84kD、66kD、63kD、48kD、46kD,均能与WMV HC-Pro结合的蛋白,其中与66kD和63kD蛋白结合反应较强;而在非介体条沙叶蝉的全蛋白中只筛选出出1种66kD蛋白,结合反应很弱,条带比较模糊;用CP做诱饵蛋白,在介体桃蚜和非介体条沙叶蝉没有鉴定出蛋白。6.用Far western blot研究了HC-Pro与CP之间的相互作用关系,结果发现,原核表达的CP蛋白能在NC膜上与HC-Pro特异结合,这不但验证了HC-Pro能与CP结合协助传毒的功能,说明体外原核表达的HC-Pro表现出与植物内分离的野生的蛋白有同样的生物功能。在研究受体蛋白、HC-Pro与CP三者互作时,受体蛋白结合HC-Pro后,不能再结合CP。综上所述,本研究对WMV基因组学进行了分析,通过用HC-Pro与CP作为诱饵,筛选到与蚜虫传毒相关的多种蛋白,为非持久性传毒机制提供了实验证据。