前言：　　 肾脏功能随年龄增长而下降,衰老是进展性肾脏疾病的重要风险之一。随着年龄的增加,有很大一部分人发生终末期肾脏病(ESRD),65-70岁间ESRD的发病率为11%,而在≥75岁的人群中,发病率则达到14%。同时,世界人口老龄化问题越来越严重,仅仅在1999年到2000年间,65岁的人由950万激增到4.2亿,预计到2030年,这个数字还将翻倍。在中国,60岁以上的人占总入口的11%(1.43亿),预计到2040年,将增加到24.8%(3.74亿),其中≥80岁的人几乎达到1亿。老年肾脏疾病正逐渐成为影响我们国民健康和社会发展的主要疾病,因此阐明肾脏衰老的分子机理具有重要的理论和临床意义。　　 目前关于肾脏衰老的机制尚不十分明确,现认为关键细胞的衰老是器官和组织衰老的病理基础,肾小球系膜细胞作为肾脏最重要的固有细胞,其表型和功能的改变在肾脏衰老进程中必然发挥着重要的作用。因此寻找系膜细胞衰老的机制,对于揭示肾脏衰老的机制有重要的指导意义。　　 STAT1是第一个被发现的STAT蛋白,在干扰素信号中发挥重要作用,主要使细胞生长停滞,促进凋亡。在我们先前的研究中已经证实,STAT1参与了肾小球系膜细胞衰老的过程,但其对系膜细胞衰老相关信号通路的影响和作用机制尚不十分清楚,本研究通过本课题组前期所建立的人肾小球系膜细胞(HMC)衰老模型即:10-6molL-1血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激72h,150μmolL-1H2O2刺激1h,然后再培养71h,探讨STAT1在HMC衰老过程中的的作用。观察血管紧张素Ⅱ受体阻断剂氯沙坦、抗氧化剂普罗布考及百令胶囊提取液对HMC衰老及STAT1信号通路的影响,探讨它们在延缓HMC衰老过程中的作用,以期进一步探讨肾脏衰老的分子机制及其防治措施。　　 材料与方法：　　 一、HMC衰老的诱导和STAT1、p-STATI、STAT3、p-STAT3及p53、p21蛋白的检测　　 采用AngⅡ和H2O2作为诱导HMC衰老的刺激因素建立HMC衰老模型,细胞同步化后分为:正常对照组(不含任何刺激因素):AngⅡ组(AngⅡ:10-6molL-1,每24h补充一次,培养72h);H2O2组(H2O2:150μmolL-1刺激1h,然后换为新鲜培养液继续培养71h)。通过细胞形态、细胞周期及细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率证实HMC衰老并用Westernblot法检测衰老各组细胞内STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、p53、p21蛋白的表达变化。　　 二、干扰STAT1表达后,HMC衰老及STAT3、p-STAT3、p53、p21表达变化　　 设计并合成针对STAT1基因的三个特异性siRNA序列,应用lipofectamine2000转染试剂将STAT1-siRNA转染入HMC。激光共聚焦显微镜鉴定转染效率,应用Westernblot、RT-PCR方法筛选最有效抑制STAT1表达的干扰序列用于后续实验。转染有效干扰序列24h后,分别用上述浓度的AngⅡ和H2O2刺激相应时间,观察各组细胞形态、细胞周期、β-半乳糖苷酶染色阳性率的变化并用Westernblot法检测各组细胞STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3、p53、p21蛋白的表达变化。　　 三、氯沙坦、普罗布考、百令胶囊提取液对HMC衰老及STAT1、p-STAT1、p53、p21变化　　 将氯沙坦、普罗布考和百令胶囊提取液提前1h加入HMC培养液中,再用AngⅡ或H2O2刺激相应时间,观察细胞周期、细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率及各组细胞内STAT1、p-STAT1、p53、p21蛋白的表达变化。　　 (一)AngⅡ作用组:　　 实验分组:正常对照组;AngⅡ组;AngⅡ+氯沙坦组(氯沙坦:10-5mol-1)AngⅡ+百令组(百令胶囊提取液:50mgL-1)　　 (二)H2O2作用组:　　 实验分组:正常对照组;H2O2组;H2O2+普罗布考组(普罗布考:40.0umolL-1)。H2O2+百令组(百令胶囊提取液:50mgL-1)　　 结果：　　 一、HMC衰老表型特征和STAT1、P-STAT1、STAT3、P-STAT3及p53、p21蛋白的表达变化　　 光镜下观察:正常对照组细胞呈条梭形生长,排列规则,细胞边界清晰,生命力旺盛。与正常组细胞相比,AngⅡ和H2O2组细胞排列不规则,多型核及双核细胞增多,细胞体积变大,胞浆区域扁平,其中可见较多颗粒或空泡。流式细胞仪分析显示:正常对照组细胞的各期比例正常,G0-G1期细胞比率为52.32±3.72%,而AngⅡ和H2O2组大部分细胞停滞于G0-G1期,S期及G2/M期则趋于消失,AngⅡ组G0-G1期细胞比率为87.3±4.49%,H2O2组G0-G1期细胞比率为82±2.88%,比正常对照组明显增加,差异有显著性(P＜0.05)。AngⅡ和H2O2组细胞β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为80.63±4.43%和79.84±5.32%,比正常对照组5.81±1.07%明显增加,差异有显著性(P＜0.05)。Westernblot结果显示,AngⅡ和H2O2组中STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3及p53和p21表达均较正常对照组增加。　　 二、干扰STAT1表达后,HMC衰老表型特征和STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3及p53、p21蛋白的表达变化　　 HMC转染后48h及72h收集细胞,分别用RT-PCR和Westernblot方法检测干扰效率,STAT1mRNA水平降低约67%,蛋白水平也明显降低,证实干扰成功,同时用阴性对照证实干扰的特异性。　　 AngⅡ组中和AngⅡ+STAT1-siRNA组中β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为80.63±4.43%和32.66±4.63%,AngⅡ+STAT1-siRNA组中G0-G1期细胞比率比AngⅡ组明显降低(62.63±4.96%vs87.3±4.49%)。　　 H2O2组和H2O2+STAT1-siRNA组中β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为79.84±5.32%和27.96±6.49%,H2O2+STAT1-siRNA组中G0-G1期细胞比率与H2O2组分别为63.96±5.8%和82±2.88%。　　 AngⅡ+STAT1-siRNA组和H2O2+STAT1-siRNA组中p53、p21表达分别比AngⅡ和H2O2组明显降低,而STAT3及p-STAT3的变化却较之反而升高。　　 三、普罗布考、氯沙坦、百令胶囊提取液对HMC衰老及STAT1、p-STAT1、p53、p21蛋白表达的影响　　 AngⅡ+氯沙坦组、AngⅡ+百令胶囊提取液组和AngⅡ组中β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为47.91±9.34%、40.87±9.49%和84.89±6.01%。氯沙坦和百令干预后G0=G1期细胞比率比AngⅡ组明显降低,分别是62.75±3.97%、64.77±5.21%和88.92±4.86%。STAT1、p-STAT1、p53、p21表达降低,氯沙坦组更明显。　　 H2O2+普罗布考组、H2O2+百令胶囊提取液组和H2O2组中β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为47.28±4.53%、55.26±5.20%和76.99±6.15%。G0-G1期细胞比率比H2O2组明显降低,分别是61.48±2.48%、64.53±4.96和82.07±3.69%。STAT1、p-STAT1、p53、p21表达降低,普罗布考组更明显。　　 结论：　　 1、在系膜细胞衰老过程中STAT1、p-STAT1表达增多。伴随STAT1活性增强,STAT3、p-STAT3、p53、p21表达升高。　　 2、转染STAT1-siRNA,干扰STAT1表达后,系膜细胞衰老减轻,STAT3、p-STAT3表达升高,p53、p21降低。提示STAT1可能直接通过p53/p21通路调控系膜细胞衰老过程;同时也提示在调控系膜细胞衰老过程中STAT1和STAT3发挥相互制约作用。　　 3、氯沙坦、普罗布考和百令胶囊提取液可以通过调控STAT1-p53-p21通路从而调控HMC的衰老过程。