【摘 要】
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本研究采集苏博美利奴羊胚胎期65 d(G1,初级毛囊形成)、85 d(G2,次级毛囊形成)、105d(G3,次级获得性毛囊形成)、135 d(G4,成熟毛囊)、出生后7 d(G5)、出生后30 d(G6)左侧肩胛
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本研究采集苏博美利奴羊胚胎期65 d(G1,初级毛囊形成)、85 d(G2,次级毛囊形成)、105d(G3,次级获得性毛囊形成)、135 d(G4,成熟毛囊)、出生后7 d(G5)、出生后30 d(G6)左侧肩胛部皮肤组织(相同时期3个样本作为生物学重复)并进行转录组的测序。运用生物信息学对毛囊发育不同时期差异的表达基因进行分析,以期能够筛选出与毛囊发育相关的候选基因,为深入了解毛囊发育的机理提供分子理论依据。同时采用RT-PCR对测序结果进行了验证,并运用PCR-SSCP技术进行了KAP16基因与毛性状关联分析。结果如下:(1)运用Illumina Hiseq 2000对6个时期苏博美利奴羊的18个皮肤样进行了RNA-seq的测序。共获得每个样本12 G的数据量,原始Reads均达到7 300万以上,Clean reads均达到6 800万以上,clean比例在90.98%-94.79%之间。(2)分析差异表达基因发现,苏博美利奴羊6个毛囊发育时期共筛选到7 879个差异表达基因,其中G2/G1共筛选出差异表达基因1 562个;G3/G2共筛选出差异表达基因2 302个;G4/G3共筛选出差异表达基因1 520个;G5/G4共筛选出差异表达基因699个;G6/G5共筛选出差异表达基因166个;G6/G1共筛选出差异表达基因6 561个。苏博美利奴羊6个毛囊发育时期共筛选到12 623个差异表达新基因,其中G2/G1共筛选出差异基因1 762个;G3/G2共筛选出差异基因2 066个;G4/G3共筛选出差异基因611个;G5/G4共筛选出差异基因842个;G6/G5共筛选出差异基因28个;G6/G1共筛选出差异基因10 691个。(3)GO功能分析发现差异表达基因在细胞成分、分子功能和生物过程中显著富集(P<0.05)。KEGG通路分析发现部分差异基因注释在Wnt、Notch、Hedgehog、TGF-β、MAPK、TNF和Hippo等通路中。通过K-means分析基因的表达趋势,发现6个时期7 879个差异表达基因可以分为10类,每一类基因在毛囊发育过程中可能发挥相近的功能。运用Cytoscape软件进行各时期差异表达基因PPI分析,发现了KRT14、FGF7、Notch1、ALB及CFTR等起关键作用的蛋白。(4)采用RT-PCR对10个差异表达的基因在基因表达水平进行了验证,发现RT-PCR结果与转录组测序结果一致,表明测序结果准确可靠。(5)采用重测序和PCR-SSCP技术,验证KAP16候选基因的2个SNPs在细毛羊群体中的遗传多态性。χ~2检验表明,C41006938T和T41007938C位点均处于哈代温伯格平衡状态(P>0.05)。C41006938T和T41007938C突变位点的多态信息含量分别为0.37和0.18,所以苏博美利奴羊群体在该基因的遗传变异处在中等水平。C41006938T不同基因型对体格大小和鉴定时体重有显著影响(P<0.05);T41007938C不同基因型对纤维直径变异系数有极显著影响(P<0.01),对剪毛量和弯曲有显著影响(P<0.05);C41006938T和T41007938C单倍型对剪毛量有极显著影响(P<0.01),对纤维直径变异系数有显著影响(P<0.05)。
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