“以俞调枢”针刺法对IBS-D大鼠PI3K/AKT信号通路影响的研究

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目的:1.通过数据挖掘的方法总结针刺治疗IBS-D的选穴规律,为“以俞调枢”针刺法治疗IBS-D提供选穴参考。2.评价“以俞调枢”针刺法治疗肝郁脾虚证IBS-D大鼠的脾虚症状、肝郁症状及内脏敏感性的整体疗效,分析“以俞调枢”对肝脾枢机的调节作用。3.探讨“以俞调枢”针刺法对IBS-D大鼠PI3K/AKT信号通路的影响。方法:1.收集和整理近20年内国内外公开发表的针刺治疗IBS-D的随机对照研究,运用频次分析法对针刺治疗IBS-D的腧穴、经络运用进行规律分析。运用关联规则算法对穴位核心处方进行统计分析,根据复杂系统熵聚类分析穴位新方组合。2.以肝郁脾虚证IBS-D模型大鼠为研究对象,随机分为模型组、常规取穴组、背俞穴组、匹维溴铵组,另取正常大鼠作为正常对照组。常规取穴组取百会、印堂及双侧足三里、太冲穴,背俞穴组取双侧脾俞、肝俞、大肠俞穴。两组针刺均留针30min,每10min以180~200 r/min速度捻转1min,共捻转3次。匹维溴铵组予1.5mg/ml匹维溴铵混悬液灌胃。各组疗程均为14天。治疗前后对各组大鼠的脾虚症状(体重、24h进食量、大便含水率),肝郁症状(糖水偏好指数)及内脏敏感性指标(避水应激实验、腹部回缩反射)进行评价。同时运用q-PCR和蛋白质印迹法检测结肠组织中PI3K/AKT信号通路相关靶点的表达。结果:1.共纳入79篇针刺治疗IBS-D的随机对照研究,提及中医证候的研究有47篇。频次分析结果表明,针刺治疗IBS-D的常见证候(频次≥4)为肝郁脾虚证、脾胃虚弱证、脾肾阳虚证;针刺治疗IBS-D的常用腧穴(频次≥9)为天枢、足三里、上巨虚、太冲、三阴交、脾俞、中脘、百会、大肠俞、印堂、关元、肝俞、阴陵泉、下巨虚、内关、肾俞;针刺治疗IBS-D的经络运用以胃经、膀胱经、脾经、肝经及任脉为主;针刺治疗肝郁脾虚证IBS-D的常用腧穴(频次≥4)为天枢、足三里、太冲、上巨虚、三阴交、百会、脾俞、印堂、中脘、肝俞、大肠俞、关元。2.关联规则分析针刺治疗IBS-D的核心穴位,结果显示设置置信度为0.9,支持度为30%时,针刺治疗IBS-D的核心穴位为天枢、足三里、上巨虚、太冲、三阴交。支持度为20%,针刺治疗IBS-D的核心穴位为天枢、足三里、上巨虚、太冲、三阴交、脾俞、中脘;设置支持度为10%,针刺治疗IBS-D的核心穴位为天枢、足三里、上巨虚、太冲、三阴交、脾俞、中脘、百会、大肠俞、印堂、关元、肝俞、阴陵泉、下巨虚。3.关联规则分析针刺治疗肝郁脾虚证IBS-D的核心穴位,结果显示设置置信度为0.9,支持度为30%,针刺治疗肝郁脾虚证IBS-D的核心穴位为天枢、足三里。支持度为20%时,针刺治疗肝郁脾虚证IBS-D的核心穴位为天枢、足三里、上巨虚、太冲、三阴交;支持度为10%,针刺治疗肝郁脾虚证IBS-D的核心穴位为天枢、足三里、太冲、三阴交、百会、脾俞、印堂、上巨虚。4.基于复杂系统熵聚类法进行新方分析,设置“相关度”为11,“惩罚度”为2,得到7个针刺治疗IBS-D的穴位新方:(1)肝俞,阴陵泉,气海,内关;(2)肝俞,印堂,三阴交,上巨虚;(3)天枢_上巨虚,少商,三阴交,少海;(4)脾俞,肝俞,大肠俞,三阴交,百会;(5)脾俞,肝俞,大肠俞,小肠俞,气海;(6)大肠俞,三阴交,百会,太冲,关元;(7)大肠俞,肾俞,百会,太冲,关元。5.造模后,肝郁脾虚证IBS-D模型大鼠食欲下降,鼠毛枯黄稀疏,明显稀烂便,肛周明显沾有粪便污迹,结肠组织HE染色均未发现明显的炎性病理改变。与正常对照组相比,模型组大鼠体重减低、24h进食量减少、大便含水率增加、糖水偏好指数降低、腹部回缩反射注水量降低、避水应激期间排便数增加,且差异具有统计学意义(P<0.01),提示肝郁脾虚证IBS-D大鼠造模成功。6.治疗后,与模型组对比,常规取穴组、背俞穴组、匹维溴铵组大鼠体重增加、24h进食量增加、大便含水率降低,糖水偏好指数升高,腹部回缩反射注水量增加,避水应激期间排便数减少,且差异具有统计学意义(P<0.01)。7.治疗后,与模型组对比,常规取穴组、背俞穴组、匹维溴铵组大鼠结肠组织PI3K、AKT、BDNF、Tr KB m RNA,P-PI3K、P-AKT蛋白的表达量均下降,且差异具有统计学意义(P<0.01)。8.治疗后,与常规取穴组对比,背俞穴组在糖水偏好指数及腹部回缩反射平均注水量更高(P<0.05),P-AKT蛋白的表达量更低(P<0.05)。结论:1.针刺治疗IBS-D以健脾疏肝,祛湿止泻为法。选穴涉及多条经脉,与IBS-D病机病位复杂相关。2.治疗肝郁脾虚证IBS-D常用的背俞穴为脾俞、肝俞、大肠俞。3.“以俞调枢”针刺法在改善IBS-D大鼠肝郁症状及内脏敏感性优于常规取穴组。4.刺激肝俞、脾俞、大肠俞可以调节肝脾枢机,改善肝郁、脾虚等症状,调节脑肠互动枢纽,改善大鼠内脏敏感性,其作用机制可能为抑制PI3K/AKT信号通路BDNF和Tr KB靶点的表达。
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