研究背景神经干细胞(NSC),特别是成体神经干细胞的发现为哺乳动物中枢神经系统(CNS)再生修复带来新的希望。神经再生贯穿整个生命过程,哺乳动物大脑每天产生数以千计的新神经元。NSC增殖、分化、凋亡等生命活动受到其周围复杂微环境信号的调控。海马神经再生障碍与神经退行性疾病发生的微环境改变有关,这些疾病包括老年认知功能障碍、阿尔茨海默病(AD)等。小胶质细胞激活和促炎因子表达为神经退行性疾病病理特征,激活的小胶质细胞产生多种促炎因子诱发炎症和氧化应激,如TNF-a,一氧化氮等,ROS诱导炎性反应破坏神经干细胞正常生长的微环境,从而抑制神经再生和线粒体功能,高水平ROS还可提升胞内Ap淀粉样蛋白的浓度,导致神经元损伤。ROS浓度升高促进细胞死亡、蛋白沉积,从而加速神经退行性疾病如AD的进展。线粒体在神经再生中发挥至关重要的作用,神经元对线粒体功能障碍特别敏感,线粒体保护和体外过表达抗凋亡蛋白可促进神经分化、增强动物大脑受损部位神经前体细胞的生存能力。Sirtuin3(SIRT3)属于Sirtuin基因家族成员,主要定位于线粒体,具有去乙酰化酶活性。SIRT3具有多种生物功能,参与调节氧化应激、能量代谢、ATP生成、ROS清除、线粒体功能等,在神经退行性、糖尿病、衰老、癌症等疾病的发生发展中发挥重要作用。衰老大鼠模型中枢听觉皮层SIRT3、SOD2表达减少,AD鼠大脑皮质神经元SIRT3表达水平也显著下降。神经元SIRT3基因缺失增加H202诱导的氧化应激死亡,SIRT3基因缺失还加剧PD模型小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元的退化。SIRT3在神经疾病发生发展中发挥一定作用,但尚未见神经干细胞SIRT3与神经再生的相关研究报道。课题组前期研究证实小胶质细胞激活产生的炎性损伤诱导NSC凋亡,抑制其分化为神经元,并与能量代谢有关。在此基础上,我们推测,SIRT3可能通过减轻氧化应激和炎症损伤、改善线粒体功能等,在小胶质细胞激活致NSC失能过程中发挥神经保护作用,促进神经再生。本课题研究可望为揭示神经炎症介导NSC失能的机制提供新观点,为AD等神经退行性疾病临床治疗和药物干预提供新靶点。目的研究SIRT3在小胶质细胞激活致NSC失能中的作用,探讨SIRT3基因过表达和干扰对NSC凋亡、增殖、分化、线粒体功能、ROS生成等生命活动的影响及相关分子机制。方法本研究采用Tanswell系统共培养小鼠神经干细胞系C17.2(NSC)和小胶质细胞BV-2(MG),C17.2细胞贴壁培养在下室,BV-2贴壁培养在上室。共培养系统中添加10 μM Aβ作用于两种细胞,BV-2细胞被激活,建立小胶质细胞激活致神经干细胞失能的细胞共培养模型。SIRT3基因过表达和干扰模型的建立：C17.2细胞与BV-2细胞共培养前,C17.2接种在细胞培养六孔板的底部,当汇合度约为40%～60%时,过表达模型添加SIRT3过表达腺病毒,干扰模型添加SIRT3-siRNA,细胞均无血清培养转染6h；而BV-2细胞接种在另一个嵌套有Transwell装置六孔板的上室底部,使BV-2细胞汇合度在C17.2细胞病毒或siRNA转染完时达到50%～60%左右；当C17.2转染完后,将贴壁培养BV-2细胞的Transwell嵌套装置移至底部贴壁培养有C17.2细胞的六孔板中,并添加10 μM Aβ作用于BV-2和C17.2细胞。利用细胞免疫荧光技术鉴定C17.2-NSC标记物nestin、并检测SIRT3的蛋白表达。采用ELISA和分光光度法检测共培养系统细胞培养液中炎性因子TNF-α、 IL-1β、IL-6和NO的浓度。使用DHE荧光探针法检测NSC细胞裂解液中超氧阴离子的水平。采用流式细胞术检测细胞凋亡与细胞周期分布。使用JC-1法检测线粒体膜电位的变化,采用酯化钙黄绿素(Calcein-AM)与氯化钴(CoCl2)共孵育法分析线粒体膜通透性转运孔的开放情况。采用qRT-PCR检测相关基因mRNA表达水平,PCR产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳。利用ELISA检测NSC胞内caspase-3、caspase-9的活性大小。采用Western blotting检测相关基因蛋白表达水平,条带灰度扫描后进行半定量分析。结果1、小胶质细胞激活对NSC功能及SIRT3表达的影响SIRT3在NSC中表达和神经再生中的功能研究目前未见报道。试验分为C17.2单独培养组(NSC组)、小胶质细胞BV-2和C17.2共培养组(MG+NSC组)、Aβ作用于C17.2组(Aβ+NSC组)、Ap作用于共培养的BV-2和C17.2细胞模型组(Aβ+MG+NSC组)。通过研究,我们发现：NSC-C17.2可表达SIRT3,且主要定位于细胞核外。小胶质细胞激活下调NSC SIRT3、MnSOD的表达水平,Aβ+MG+NSC组NSC SIRT3与Mn-SOD蛋白表达水平显著低于Aβ+NSC组,两者mRNA表达水平也显著降低(P=0.000,P=0.003)。Ap激活小胶质细胞分泌炎性因子和NO, NSC胞内ROS水平升高,诱发氧化应激。表现为：与Aβ+NSC组比较,Aβ+MG+NSC组细胞培养液中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO浓度显著增大(P=0.000,P=0.002,P=0.012,P=0.000),且NSC细胞裂解液中超氧阴离子、过氧化氢水平显著升高(P=0.000,P=0.000)。AP+MG+NSC组NSC细胞凋亡率明显增大(P=0.000), NSC G0/G1细胞数量明显增多(P=0.000),S期、G2/M期细胞比例显著减少(P=0.000,P=0.002)。Aβ+MG+NSC组NSC JC-1红色／绿色荧光强度比值显著变小(P=0.003),Calcein-AM绿色荧光强度显著减弱(P=0.034)。2、NSC SIRT3在小胶质细胞激活致NSC损伤中的作用从过表达和干扰SIRT3正反两方面研究NSC SIRT3在小胶质细胞激活致NSC损伤中的作用。过表达组分为Control空白对照组、Vector空载体腺病毒转染组、SIRT3过表达腺病毒转染组；干扰组分为Control空白对照组、Scrambled siRNA阴性对照组、siSIRT3干扰组。过表达组结果显示,SIRT3过表达组NSC SIRT3、Mn-SOD mRNA表达水平显著高于Control组(P=0.000,P=0.000),约为Control组表达水平的8倍左右,SIRT3、Mn-SOD蛋白表达也显著上调。与Control组比较,SIRT3过表达组NSC DHE红色荧光强度减弱、超氧阴离子水平显著降低(P=0.009),过氧化氢浓度明显减小(P=0.008)。与Control组比较,SIRT3过表达组NSC细胞凋亡率显著减小(P=0.003),G0/G1期细胞所占比例显著减小(P=0.005),S、G2/M期细胞所占比例显著增大(P=0.004,P=0.013)。SIRT3过表达组NSCJC-1红/绿荧光强度比值显著大于Control组(P=0.004)。与Control组比较,SIRT3过表达组NSC线粒体CypD蛋白表达明显减少,Calcein-AM绿色荧光强度显著增强(P=0.006)。与Control组比较,SIRT3过表达组线粒体Cyt C释放到胞浆明显减少,促凋亡因子cleaved caspase-3、Bax蛋白表达明显下调,凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达明显增多,caspase-3、caspase-9酶活性均显著减弱(P=0.012,P=0.022)。干扰组结果表明,siSIRT3干扰组NSC SIRT3、Mn-SOD mRNA表达水平显著低于Control组(P=0.000,P=0.000),约为Control组水平的26%左右,SIRT3、 Mn-SOD蛋白表达也显著减少。siSIRT3干扰组NSC超氧阴离子、过氧化氢浓度显著大于Control组(P=0.003,P=0.006)。与Control组比较,siSIRT3干扰组细胞凋亡率明显升高(P=0.001),G0/G1期细胞所占比例显著增大(P=0.012),S期细胞所占比例显著减小(P=0.003)。与Control组比较,siSIRT3干扰组NSCJC-1红/绿荧光强度比值显著变小(P=0.001),Calcein-AM绿色荧光强度明显减弱(P=0.013),线粒体CypD蛋白表达增多。与Control组比较,siSIRT3干扰组线粒体Cyt C释放到胞浆明显增多,促凋亡因子cleaved caspase-3、Bax蛋白表达水平明显上调,凋亡抑制因子Bcl-2蛋白表达明显减少,caspase-3、 caspase-9活性显著增强(P=0.001,P=0.011)。正反两方面结果证实,NSC SIRT3可上调MnSOD表达,显著降低胞内ROS水平,抑制NSC凋亡,促进细胞分裂,使线粒体膜电位上升,减少线粒体膜通透性转运孔开放及CypD蛋白表达；SIRT3表达抵抗小胶质细胞激活致NSC失能的作用机制,与线粒体Cyt C释放到胞浆减少,Bax表达减少,Mn-SOD、Bcl-2表达上调,及caspase-3/9活性受到抑制有关。3、SIRT3对NSC分化的影响及相关机制小胶质细胞激活产生氧化应激与炎症破坏脑内微环境,影响成年神经再生,SIRT3可抵抗小胶质细胞激活对NSC产生的损害。采用过表达腺病毒和siRNA转染共培养模型中NSC,探讨SIRT3对全反式维甲酸诱导C17.2-NSC分化的影响及相关分子机制。试验分为NSC组、Control模型组、SIRT3过表达组、siSIRT3干扰组,各组均添加1μM维甲酸诱导NSC分化48 h。结果显示,与Control模型组比较,SIRT3过表达组NSC NeuN、MAP-2 mRNA表达水平明显上调(P=0.002,P=0.001),而nestin和GFAP mRNA表达明显减少(P=0.001,P=0.000),siSIRT3干扰组NSC NeuN、MAP-2 mRNA表达水平则显著降低(P=0.001, P=0.000), nestin和GFAP mRNA表达水平则明显升高(P=0.003, P=0.005), Western blotting结果显示,各组蛋白表达与mRNA水平变化趋势一致。与Control模型组比较,SIRT3过表达组NSC β=catenin、 p-GSK-3β蛋白表达明显增加(P=0.001,P-0.001), p-β-catenin、GSK-3β、Axin2表达明显下调(P=0.001,P=0.026,P=0.000),siSIRT3干扰组NSC β-catenin、 p-GSK-3p蛋白表达则显著减少(P=0.006,P=0.000),p-β-catenin、GSK-3β、 Axin2表达显著上调(P=0.020,P=0.000,P=0.000)。结果说明,SIRT3过表达诱导共培养系统NSC向神经元分化,当SIRT3干扰后,NSC向神经元分化减少,转而分化为胶质细胞。SIRT3促进NSC分化为神经元,与Wnt/β-catenin信号通路有关,是通过上调β-catenin、p-GSK-3β表达,下调p-β-catenin、GSK-3β、Axin2表达实现的。结论(1)Aβ激活小胶质细胞诱发共培养NSC氧化应激和炎性损伤,并下调NSCSIRT3基因表达；(2) NSC SIRT3可缓解小胶质细胞激活诱发的NSC损伤,抑制细胞凋亡,促进细胞分裂,改善线粒体功能；(3) NSC SIRT3抵抗小胶质细胞激活致NSC失能的作用机制,与减少线粒体膜通透性转运孔开放及CypD表达,抑制线粒体Cyt C向胞浆释放、减小Bax/Bcl-2比值、降低caspase-3/caspase-9活性有关；(4) SIRT3促进NSC向神经元分化,Wnt/β-catenin信号转导通路激活介导此过程；(5)研究结果可为NSC生存微环境的改善提供新认识,为AD等神经退行性疾病的防治提供新靶点。