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背景慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)在我国的发病率高达10.8%,严重危害国民的健康。CKD在我国乃至世界已经成为重要公共卫生问题。导致CKD发生发展的机制仍尚未阐明。肾小管周围因为微血管稀疏是肾小管上皮细胞常常因缺氧等应激而易发生损伤的组织病理学特点。研究也已证实,慢性缺氧是通过损伤肾小管促进肾间质纤维化的重要原因,在各种CKD患者的肾组织中均存在慢性缺氧现象,因此肾间质纤维化成为CKD进到终末期的共同病理表现。深入研究慢性肾脏病缺血缺氧的细胞及分子机制,寻找有效的干预肾间质纤维化靶点,对阻止或延缓CKD的发生发展具有重要意义。肾小管和肾小管间质构成肾脏的重要部分,是对缺氧,蛋白尿,毒素和代谢异常等损伤的主要反应部位。越来越多的证据表明,肾小管上皮细胞在肾脏修复或进展为CKD过程中发挥着不可替代的作用。近端肾小管上皮细胞(Proximal tubular epithelial cell,PTC)是皮质中主要的上皮细胞类型,是体内最耗能的细胞,其充满线粒体并依赖于脂肪酸的氧化磷酸化作用。肾小管在缺血缺氧条件下氧供的减少首先会造成脂肪酸氧化(Fatty acidβ-oxidation,FAO)的停滞,在持续损伤的时间内,存活的PTC受到新陈代谢的限制,表现出表型转变,从上皮细胞表型转换为能量要求低一级的间质细胞表型(EMT),也包括细胞骨架重排和细胞外基质蛋白的产生,因此缺氧过程中肾小管上皮细胞脂肪酸氧化被意外阻断是AKI发生的主要原因。并且FAO在发生障碍后无法正常恢复,这表明肾小管上皮细胞必须应对持续的能量缺乏,这也可能是短暂的AKI也会增加CKD发生的风险进而导致肾间质纤维化的原因之一。因此推测肾小管上皮细胞脂肪酸代谢动态平衡的失调是导致肾小管上皮细胞损伤的关键。其中具体的分子机制和细胞机制是什么,将是本课题要研究的重点。我们前期发现Twist1可通过诱导肾小管上皮细胞转分化参与缺氧导致肾间质纤维化,高表达的Twist1可以诱导细胞脂滴的聚集,提示Twist1可能通过脂肪酸代谢途径介导慢性缺氧性肾损伤。进一步研究发现,代谢相关转录因子PGC-1α、PGC-1β、PPARα、PPARγ等的表达在缺氧性肾小管上皮细胞中显著降低,且与Twist1的表达和脂滴聚集呈负相关。报告基因实验也证实Twist1可以直接转录抑制PGC-1α进而抑制PPARα。由此,我们推测:“在缺氧微环境下Twist1可能通过抑制PGC-1α以及下游靶基因PPARα、CPT1、ACOX1的表达,导致肾小管脂肪酸代谢障碍,进而导致肾间质纤维化”。本课题将通过体内外实验证实这一推论,为阐明缺氧性肾损伤机制和寻找新的防治手段提供理论依据。目的1)研究慢性缺氧对肾小管脂肪酸代谢稳态的影响。2)筛选和鉴定调控缺氧诱导脂肪酸代谢障碍促进肾间质纤维化的关键分子。3)Twist1通过抑制PGC-1α调控脂肪酸代谢障碍诱导肾间质纤维化的分子机制。4)基于肾间质纤维化模型,利用Twist1(-/-)转基因鼠研究Twist1对脂代谢的影响及分子机制。方法1)通过油红O(Oil Red)染色和电镜技术检测脂肪酸氧化障碍导致的甘油三酯堆积。2)通过海马细胞能量代谢实时测定仪/生物能量代谢测定仪XFe24(Seahorse XFe Extracellular Flux Analyzer)检测常氧和缺氧条件下肾小管上皮的耗氧率(Oxygen consumption rate,OCR),分析脂代谢效率的变化。3)基于缺氧性肾间质纤维化模型,利用Twist1(-/-)转基因小鼠,通过基因测序,蛋白测序,肾组织病理学、Western Blot法、免疫组化等方法研究Twist1分子网络通过诱导脂肪酸代谢障碍导致间质纤维化的机制。4)建立缺氧性肾间质纤维化小鼠模型,通过检测肾脏功能指标、尿蛋白、肾组织病理学、荧光素酶报告基因,Ch IP等方法研究Twist1/PGC-1α/PPARα通路诱导脂肪酸代谢障碍的作用。结果1)在生理状态下,肾小管上皮细胞脂肪酸氧化代谢处于稳态,缺氧条件下脂肪酸氧化代谢发生障碍。2)缺氧促进了Twist1的高表达,显著降低了肾小管上皮细胞脂肪酸氧化代谢,缺氧条件下体外沉默Twist1可以缓解缺氧诱导的脂肪酸代谢障碍3)在缺氧性肾纤维化模型中,过表达Twist1通过抑制了脂肪酸氧化关键分子PGC-1α、PPARα促进了脂肪酸代谢障碍,诱导了肾间质纤维化。4)肾小管特异性敲除Twist1基因小鼠对缺氧导致的脂肪酸代谢障碍的缓解作用,进而对肾功能和肾间质纤维化有保护作用。结论因此,我们的研究表明缺氧诱导肾小管上皮细胞Twist1高表达,通过抑制代谢相关转录因子PGC-1α,进而抑制了PGC-1α的与下游靶基因例如脂肪酸氧化代谢相关的PPARα,CPT1,ACOX1的表达和活性,导致肾小管脂肪酸代谢障碍,进而导致肾间质纤维化,为阐明缺氧性肾损伤机制提供了新的理论依据。