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钙调磷酸酶B亚基蛋白(calcineurin B-like protein,CBL)是一种钙结合蛋白,在植物逆境信号传导中发挥重要功能。CBL蛋白和与其相互作用的蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)是CBL/CIPK信号系统的基本要素。该信号系统在植物高盐、干旱以及低温等非生物胁迫中起着关键作用。钙离子作为植物中一种必不可少的第二信使,在植物遭受逆境胁迫通过其浓度的时空变化来传导胁迫信号,CBL蛋白能够感知逆境Ca2+信号,并与Ca2+结合,进而激活其下游蛋白激酶CIPK,并与其形成CBL-CIPK复合体,对转录因子及胁迫应答基因进行调节,调控不同细胞水平以及组织部位的抗逆性,从而帮助植物应对逆境胁迫带来的影响。驱动基因表达的启动子是转录水平调控基因表达的重要元件,对启动子结构与功能的深入研究有助于了解基因在植物生长发育与逆境防御中的作用机制,进而为有针对性的进行植物的抗逆改良提供依据。本研究从大豆中克隆GmCBL4基因启动子(CblP1)全长及其不同长度5’缺失片段,并分别构建植物表达载体,转化烟草,为启动子功能分析奠定了基础;同时克隆了大豆GmCBL10基因并转化烟草,为该基因的功能分析和利用转基因技术培育大豆抗逆品种奠定了基础。本研究的主要研究结果如下:1.根据植物基因组数据库Phytozome中大豆GmCBL4基因上游序列设计引物,从大豆中克隆得到GmCBL4基因启动子序列,序列长度为1876bp,命名为CblP1。通过启动子在线分析软件PLACE和PlantCARE预测发现,该序列中含有保守结构域TATA-box和CAAT-box,以及一些非生物胁迫应答顺式作用元件(MBS干旱诱导相关元件、LTR低温诱导相关元件)、光诱导信号转导元件、激素应答顺式作用元件以及花粉发育特异性激活元件等,预测结果表明该启动子具有逆境胁迫诱导特性。构建了该启动子驱动的植物双元表达载体pCAMBIA1301-CblP1通过农杆菌介导转化烟草,获得2株CblP1融合gus报告基因的阳性转化植株。2.为寻找该启动子的核心功能区,进一步对该启动子进行5’端缺失分析,克隆了4个不同长度的5’端缺失片段,序列长度分别为1399bp(Cbl P2)、932bp(CblP3)550bp(CblP4)和248bp(CblP5),并分别构建5’端缺失片段驱动的植物双元表达载体,分别为pCAMBIA1301-Cbl P2、pCAMBIA1301-CblP3、pCAMBIA1301-CblP4和pCAMBIA1301-CblP5,通过农杆菌介导转化烟草,获得2株CblP3融合gus报告基因的阳性植株。3.利用农杆菌介导法将5种启动子植物表达载体分别对烟草进行瞬时转化,经过GUS组织化学染色分析发现,全长启动子序列CblP1(1876bp)和5’缺失启动子序列CblP2(1399bp)、CblP3(932bp)具有启动活性,且CblP3启动活性最强;CblP4(550bp)和CblP5(248bp)无启动活性。推测该启动子核心功能区可能位于-932~-550区域内。4.以大豆RNA反转录的cDNA为模板,从大豆中克隆获得了大豆GmCBL10基因序列,全长1049bp,其中ORF区792bp,共编码263个氨基酸。对该基因所编码蛋白的理化性质、二级结构、信号肽、跨膜结构域及亚细胞定位预测分析,发现该蛋白属于酸性、亲水性蛋白,无信号肽,含有典型的EF-hand结构域和1个跨膜结构域,主要定位于细胞质和线粒体中。系统进化分析表明,GmCBL10与菜豆中同源蛋白的亲缘关系最近。克隆带有同源重组接头的大豆GmCBL10基因CDS序列,通过同源重组的方法构建了植物表达载体pCPB-GmCBL10,冻融法转化农杆菌EHA105,叶盘法转化烟草,经PCR鉴定获得3株阳性转GmCBL10基因植株。