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大肠癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,其发病率呈上升趋势,易于发生局部淋巴结和远处转移,目前主要采取以手术和放、化疗为主的综合治疗,但是临床上多数肿瘤的放、化疗疗效较低,且同样治疗条件下,不同肿瘤患者即使肿瘤类型、病理分级、部位等都相同,治疗效果也存在较大差异,表明肿瘤细胞的内在放、化疗敏感性(intrinsic chemoradiotherapy sensitivity)有显著不同。DNA损伤修复系统作为机体抵抗各种损伤的分子基础,对于维护基因组的稳定与完整起着至关重要的作用,然而对于通过损伤DNA杀死癌细胞的放、化疗,这一过程无疑削弱了治疗效果。DNA损伤修复基因脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(apurinic/ apyrimidinic endonuclease, APE1)具有核酸内切酶及氧化还原双功能,是细胞放射性损伤和基因毒性药物烷化剂致伤的重要修复因子,并通过氧化还原机制调节多种转录因子的DNA结合活性及下游靶基因表达,而这些转录因子与肿瘤放化疗抵抗密切相关。因此本研究以APE1为靶点,构建人APE1 siRNA重组腺病毒载体Ad5/F35-APE1 siRNA,研究其体内外对大肠癌细胞感染效率和对APE1基因表达的“敲除”作用,及其体内外增强大肠癌放化疗敏感性的作用及其分子机制。研究目的1.探讨APE1基因在大肠癌发生发展中的作用,以确证APE1为大肠癌治疗潜在的分子靶点;2.探讨以APE1为靶点的基因治疗在大肠癌治疗及放化疗增敏中的临床应用前景;3.探讨新型嵌合型腺病毒载体Ad5/F35在大肠癌基因治疗中的临床应用前景。研究内容和方法1. APE1在大肠癌组织表达及其临床意义:采用免疫组化方法检测大肠癌组织APE1蛋白表达,分析APE1表达与大肠癌临床病理因素的关系,为进一步以APE1为靶点的基因治疗提供临床病理基础。2. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒构建及鉴定:选用新型嵌合型腺病毒Ad5/F35为载体,首先设计合成APE1 siRNA cDNA序列与线性化pDC316-U6-EGFP质粒连接后构建腺病毒穿梭载体pDC316-EGFP-U6-APE1 siRNA,经测序鉴定确认,与骨架质粒pBHG35共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad5/F35-APE1 siRNA,经PCR鉴定毒种正确后大量扩增纯化,TCID50法测定腺病毒滴度。采用流式细胞术检测Ad5/F35-APE1 siRNA对大肠癌细胞感染效率;Western blot和免疫组化检测其对大肠癌细胞APE1基因的沉默作用;采用[γ-32P]ATP标记寡核苷酸法检测AP内切酶活性。3. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强大肠癌放疗敏感性的实验研究:分别采用经典的克隆形成分析和裸鼠移植瘤模型检测大肠癌LOVO细胞体内外的放射效应;碱性彗星分析法检测DNA损伤;TUNEL法检测LOVO细胞凋亡;Western blot和免疫荧光染色检测APE1蛋白表达;凝胶迁移法(EMSA)测定NF-κB的DNA结合活性。4. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强大肠癌5-FU化疗敏感性的实验研究:MTT法检测不同剂量5-FU作用LOVO细胞存活率的改变;TUNEL法检测LOVO细胞凋亡;Western blot和免疫荧光染色检测APE1蛋白表达; EMSA测定NF-κB的DNA结合活性。研究结果1. APE1在大肠癌组织表达及其临床意义:正常大肠粘膜APE1呈胞核阳性表达。大肠腺瘤和大肠癌组织APE 1表达特征发生改变,呈胞核表达、单纯胞浆表达或核浆共同表达,大肠癌组织APE1胞浆异位表达率为73.6%,大肠腺瘤APE1胞浆异位表达率为83.3%,二者无显著性统计学差异,但均显著高于癌旁大肠粘膜和正常大肠粘膜(P<0.01)。大肠癌组织APE1胞浆异位表达率与临床分期和淋巴结转移有关。2. Ad5/F35-APE1 siRNA构建及鉴定:分别通过测序分析和PCR鉴定腺病毒穿梭载体pDC316-EGFP-U6-APE1siRNA和腺病毒载体Ad5/F35-APE1 siRNA正确,成功构建了APE1 siRNA腺病毒表达载体Ad5/F35-APE1 siRNA,滴度达1.6×1010 IU/mL。Ad5/F35腺病毒对大肠癌细胞的感染效率显著高于Ad5型腺病毒,20 MOI的Ad5/F35-EGFP和Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒对LOVO细胞的感染效率可达99%,而20 MOI的Ad5-EGFP对LOVO细胞的感染效率只有15%左右;体内研究发现,5×108 IU的Ad5-EGFP、Ad5/F35-EGFP、Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒裸鼠移植瘤瘤内局部注射3 d后,Ad5/F35-EGFP和Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒组可见大量EGFP阳性细胞,而Ad5-EGFP腺病毒组可见少量EGFP阳性细胞。Ad5/F35-APE1 siRNA能显著抑制大肠癌细胞APE1蛋白表达和AP内切酶活性,且呈剂量依赖性。3. Ad5/F35-APE1 siRNA增强大肠癌放疗敏感性的实验研究:Ad5/F35-APE1 siRNA显著增强大肠癌LOVO细胞体内外的放射敏感性。体外实验结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA的放射增敏比分别为:SER(D0)为1.23,SER(Dq)为5.75;且Ad5/F35-APE1 siRNA加强放疗诱导的LOVO细胞凋亡。碱性彗星分析结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA抑制放疗后大肠癌细胞DNA修复能力。体内实验结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA放疗组肿瘤生长较Ad5/F35-EGFP放疗组明显被抑制,单纯Ad5/F35-APE1 siRNA组肿瘤抑制率为15.06%,对照Ad5/F35-EGFP放疗组肿瘤抑制率为41.41%,Ad5/F35-APE1 siRNA放疗组肿瘤抑制率为70.90%。放疗呈剂量依赖性诱导LOVO细胞APE1蛋白表达增强,同时伴有NF-κB的DNA结合活性增强,Ad5/F35-APE1 siRNA抑制LOVO细胞NF-κB组成性和放疗诱导的激活。4. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强大肠癌5-FU化疗敏感性的实验研究:感染Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒比感染对照腺病毒的LOVO细胞对5-FU的敏感性明显增强,IC50分别为1.69μM和7.04μM;且Ad5/F35-APE1 siRNA加强5-FU诱导的LOVO细胞凋亡。5-FU呈剂量依赖性诱导LOVO细胞APE1蛋白表达增强,同时伴有NF-κB的DNA结合活性增强,Ad5/F35-APE1 siRNA抑制LOVO细胞5-FU诱导的APE1蛋白表达以及NF-κB组成性和5-FU诱导的激活。结论1. APE1胞浆异位表达可能与大肠癌的发生、侵袭和转移有关,APE1是大肠癌治疗潜在的分子靶点,具有重要的临床应用价值。2. Ad5/F35腺病毒对大肠癌细胞的感染效率显著高于Ad5型腺病毒,更适用于大肠癌的基因治疗。3.放疗和5-FU呈剂量依赖性诱导大肠癌细胞APE1蛋白表达增强,同时伴有NF-κB的DNA结合活性增强,Ad5/F35-APE1 siRNA抑制放疗和5-FU诱导的APE1表达和NF-κB激活,APE1可能在肿瘤放化疗抵抗中起重要作用。4. Ad5/F35-APE1 siRNA可特异性沉默大肠癌细胞APE1蛋白表达,沉默效率达到95%。5.以APE1为靶点的基因治疗体内外显著增强大肠癌细胞放射敏感性,主要是通过2种机制实现的,一方面通过抑制大肠癌细胞放疗后的亚致死损伤修复能力;另一方面通过抑制NF-κB等放疗抵抗有关的转录因子活性。6.以APE1为靶点的基因治疗体外显著增强大肠癌细胞5-FU化疗敏感性,其机制可能主要是通过抑制大肠癌细胞碱基切除修复和NF-κB等放疗抵抗有关的转录因子活性。