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研究背景及目的:理想的骨修复材料一直是骨外科的亟需品,然而目前的研究遭遇重重障碍,最具希望的骨组织工程也由于其种子细胞、支架材料和构建策略三大要素分别面临诸多难题而致使其发展应用遭遇瓶颈。选择性细胞滞留技术是传统骨组织工程在构建策略上的一种改良手段,这种改良不仅可以突破传统骨组织工程在构建策略上的关键性难题,并且由于采用自体骨髓的细胞成分作为即用型种子细胞,若策略得当,可同时解决传统骨组织工程种子细胞在扩增周期、潜在致瘤性、免疫原性以及伦理学等方面诸多棘手的难题,这样一来,支架材料的性能便成为了选择性细胞滞留技术最为关键的决定因素。由于选择性细胞滞留技术旨在尽量缩短构建时间以满足临床上对骨修复材料随取随用的要求,如此其要求的支架材料需要在性能上兼顾生物相容性、骨诱导性和快速的细胞粘附能力。基于以上背景,我们设想将成熟的促粘修饰物赖氨酸序列与具备特异性粘附能力和成骨诱导能力的RGD序列相结合,设计制备出Lysine-cyclic RGD(Lc RGD)肽,以物理电荷和生物配基相结合的方式协调非特异性粘附与特异性粘附,并在提高选择性细胞滞留技术中支架材料对骨髓中细胞快速粘附能力的同时兼顾成骨诱导能力。方法:(1)查阅文献,根据对合成物目标性能的实际要求,选用了具备较长半衰期、较好细胞粘附性并兼顾对MSCs成骨诱导性能的c(RGDf K)环五肽作为主体结构,再加上20K的赖氨酸序列以增强其非特异性粘附能力,最终课题组设计了LcRGD肽的结构,并以固态合成法和HPLC法等进行了制备、纯化和验证,以LcRGD肽对DBM进行了修饰并以激光共聚焦显微镜、环境扫描电镜、能谱分析等方法验证了修饰的有效性和稳定性。(2)以离心细胞粘附实验、CCK-8法、Western Blot、qPCR、碱性磷酸酶活性检测等方法在体外检测了LcRGD肽对间充质干细胞的粘附性能和成骨诱导能力。(3)以流式细胞仪、裸鼠股骨旁成骨实验、影像学方法和病理学方法检测了DBM/LcRGD支架材料对骨髓中有核细胞的粘附能力和体内成骨能力。结果:(1)课题组成功设计和获取了高纯度的Lc RGD肽,环境扫描电镜观察到经LcRGD肽修饰的DBM表面粗糙度有所提高,能谱分析亦显示Lc RGD肽被成功地修饰于DBM表面。以带FITC荧光的LcRGD肽修饰DBM后以激光共聚焦显微镜进行三维重建,证实了修饰的有效性,随后将DBM/LcRGD-FITC支架材料以PBS缓冲液进行高载荷的模拟富集后再次以激光共聚焦显微镜进行三维重建,结果显示LcRGD-FITC肽经过较高强度的冲刷后仍然较为稳定地修饰于DBM表面。(2)离心细胞粘附实验结果显示,相对于普通cRGD肽修饰的盖玻片和未经修饰的盖玻片,Lc RGD肽修饰的盖玻片对体外培养的间充质干细胞在早期便具有更强的粘附能力。CCK-8实验证实了以MSCs细胞悬液模拟选择性细胞滞留技术后,相对于DBM/cRGD和DBM支架材料,DBM/LcRGD支架材料滞留了更多MSCs,并且MSCs在DBM/LcRGD支架材料上的增殖最先到达峰顶密度。将以MSCs细胞悬液模拟选择性细胞滞留技术后DBM/LcRGD、DBM/c RGD和DBM支架材料以成骨诱导培养基进行诱导后以q PCR、WesternBlot和碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行检测,结果发现DBM/LcRGD组具有更高的Runx2、ALP、OPN和OCN的基因表达水平和蛋白表达水平,以上结果表明LcRGD肽具有更好的诱导MSCs成骨分化的能力。(3)以选择性细胞滞留技术采用健康成人骨髓对DBM/LcRGD、DBM/c RGD和DBM支架材料进行富集,流式细胞仪结果显示DBM/LcRGD组对骨髓中有核细胞、单核细胞、CD90+/CD105+双阳性细胞以及CD34+细胞的富集效率显著高于对照组并展现出了一定的靶向粘附能力。以裸鼠股骨旁成骨实验对DBM/Lc RGD和DBM支架材料进行体内实验观察,影像学和病理学方法均显示DBM/LcRGD组具有更好的体内成骨能力。结论:以设计制备的Lc RGD肽修饰DBM所得的DBM/LcRGD支架材料具有良好的生物相容性、细胞粘附能力和成骨诱导性能,在运用于选择性细胞滞留技术时其对骨髓中细胞的粘附滞留能力较好并展现出一定的靶向粘附能力,最终亦展现了较好的体内成骨能力。作为运用于骨组织工程的支架材料修饰物,LcRGD肽尤其适用于选择性细胞滞留技术并具有良好的实际应用前景。