副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪上呼吸道的常在菌,可引起多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为主要特征的革拉泽氏病(Gl?sser’s Disease)。Qse B/Qse C双组份调控系统由组氨酸蛋白激酶和反应调节子组成,在肠杆菌科和巴斯德菌科中是重要的毒力调控因子。探究副猪嗜血杆菌Qse B/Qse C双组份系统在副猪嗜血杆菌致病过程中的作用和机制对认识该病原和防控该病具有重要的意义。本研究以临床分离的野生菌株(SC1401和MY1902)为参考对照株,采用自然转化法分别构建副猪嗜血杆菌Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株。通过抗血清杀菌试验、生物被膜形成试验、压力耐受试验、抗生素耐药性试验和小鼠毒力试验等比较缺失株和野生菌株的差异,鉴定Qse B/Qse C双组份调控系统的毒力相关性。利用比较转录组学探究Qse B在副猪嗜血杆菌致病过程中的作用和调控机制。主要研究内容包括:1.构建副猪嗜血杆菌Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株和互补株选择“自杀质粒”p K18mobsac B构建外源“打靶载体”p LQ1、p LQ2和p LQ4,通过自然转化法分别转入副猪嗜血杆菌野生菌株,经卡那霉素抗性筛选得到Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株。此外,本研究分别克隆qse B、qse C和qse BC双基因的启动子及其完整编码序列分别连接到PSF116载体,将重组质粒通过自然转化法分别转入Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株,经庆大霉素和卡那霉素抗性筛选获得其互补菌株C-Δqse B、C-Δqse C和C-Δqse BC。通过PCR和Western blotting检测基因缺失株和互补菌株构建成功。2.副猪嗜血杆菌Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株生物学特性及对小鼠毒力的研究本研究分别对Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株与野生菌株的生物学特性进行了比较分析。生长试验结果表明,Δqse B和Δqse BC基因缺失株与野生菌株SC1401相比生长速度明显变慢,互补株恢复了生长能力;而Δqse C与野生菌株MY1902相比生长速度没有明显差别。生物被膜试验结果表明,Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株生物膜形成能力显著低于野生菌株;通过扫描电子显微镜观察发现,SC1401形成了大量生物膜,大部分细菌形态完整;Δqse BC几乎没有观察到生物膜形成,细菌失去了正常形态裂解死亡。药物敏感试验表明,Δqse BC基因缺失株的浮游菌和生物被膜菌对头孢噻呋、氨苄青霉素、多粘菌素B、强力霉素等药物的敏感性显著高于野生菌株SC1401。抗血清杀菌试验显示,Δqse B和Δqse BC基因缺失株对血清中补体的敏感性显著增加。环境胁迫试验结果中,Δqse C和Δqse BC基因缺失株对氧化、高温和高渗压力的敏感性均高于野生菌株。小鼠腹腔攻毒试验中,Δqse B、Δqse C和Δqse BC基因缺失株的致死率显著低于野生菌株。结果显示,Qse B/Qse C双组份系统参与调控副猪嗜血杆菌多种生物学功能,具有毒力相关性。3.副猪嗜血杆菌野生菌株SC1401和Δqse B缺失株比较转录组学的研究双组份系统Qse B/Qse C中,Qse C感受外界的信号分子并发生自磷酸化,然后将磷酸基团转移给其调节蛋白Qse B,磷酸化的Qse B通过调节运动和毒力相关基因的转录在细菌的毒力、鞭毛和生物膜形成等方面发挥着重要作用。鉴于Δqse B基因株具有明显的生物学特性变化,本研究用RNA-seq技术对副猪嗜血杆菌野生菌株SC1401和基因缺失菌株Δqse B进行比较转录组学研究,进一步探究生物学表型产生的原因。鉴定出624个差异基因,Δqse B中转录上调基因351个,转录下调基因273个。SC1401和Δqse B共同表达基因2058个,SC1401单独表达的基因为5个,Δqse B单独表达的基因为31个。生物学过程(转运、对压力的应答、转录调控、有机环状化合物的生物合成)和分子功能(ATP酶活性、序列特性DNA结合、抗氧化活性)等条目上的GO富集非常显著。本研究还进行了KEGG通路分析,其中ABC转运、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、TCA循环、磷酸戊糖途径和磷酸转移酶系统均有较多的差异基因富集。根据转录组测序结果,绘制副猪嗜血杆菌中qse B基因的调控网络图。