癌症是全世界的主要死因。多糖对肿瘤的作用机制是多样化的。多糖具有多种生物活性,因为它们的复杂结构,这使得它们成为最重要和最有吸引力的生物大分子之一。研究多糖的抗癌活性,必须研究多糖和多糖化合物在生物系统中的功能。在以前的研究中,多糖只用作一种结构材料或储能材料。缺乏对多糖在生活系统中的作用的研究,必然导致多糖资源利用不足。然而近十多年以来,多糖由于其副作用小、基本无毒性和生物活性丰富被广泛应用于科学研究,特别是药物的研发制作。尤其是海洋植物多糖和动物多糖,因为海洋生物物种丰富且生活环境特殊,让海洋多糖的开发利用成为研究热点。瘤背石磺是典型的海洋底栖动物,属于软体动物门,是一种无贝壳、裸露着的雌雄同体两栖贝类。在中国分布于各个沿海地区,它们地域分布很广、不能人工养殖,是一种因营养价值和药用价值都较高而被广为称赞的野生型经济贝类,因而也经常被称为土海参。瘤背石磺肌肉组织中蛋白质含量高达60%多,多糖含量高达26%,远远高于其他贝类,是一种研究海洋多糖药用价值的优良选择。因此探究瘤背石磺多糖的抗肿瘤活性对海洋药物的开发具有重要意义。本文以提取瘤背石磺肌肉组织中多糖为材料,以体外培养Hela细胞为实验对象,利用多糖化学修饰方法为条件,进而研究瘤背石磺的抗肿瘤活性以及瘤背石磺多糖结构改变后对其抗肿瘤活性的影响,从而验证瘤背石磺多糖的抗肿瘤活性和瘤背石磺的药用价值,同时为通过阐明多糖的结构和生物活性关系,一方面阐明影响多糖抗肿瘤活性的分子结构,寻找更多具有抗肿瘤潜力的多糖,另一方面研究多糖发挥凋亡的运行路径,对人类研究抗癌药物、降低癌症死亡率意义非凡。1、瘤背石磺多糖的结构修饰通过热水浸提法提取瘤背石磺多糖,再经过胰蛋白酶-Sevag处理法对瘤背石磺多糖进行脱蛋白,进而透析干燥得多糖含量是89.6%的瘤背石磺多糖。将瘤背石磺多糖进行浓硫酸法修饰,经硫酸根和取代度测定获得多糖含量为44%的硫酸化瘤背石磺多糖;再将其进行磷酸化修饰,经钼蓝比色法测磷酸根含量后,得多糖含量为37%的磷酸化多糖,最后进行乙酰化修饰,通过碱性羟胺比色法测乙酰化程度,得多糖含量为35%的乙酰化瘤背石磺多糖。分别将各组瘤背石磺多糖制成低、中、高三种浓度以备后续研究使用。多糖的分子量、主侧链结构和糖苷键等因素都是影响其生物活性的重要原因。对瘤背石磺多糖进行此类化学结构修饰有助于阐明贝类多糖的抗肿瘤活性的分子机制。2、瘤背石磺多糖对体外培养的Hela细胞增殖抑制作用通过对瘤背石磺多糖的化学修饰,获得了三种结构不通的瘤背石磺多糖,将四组瘤背石磺多糖一起制成不同浓度的药物组,对照组为阳性药物顺铂,首先用MTT法检测评估各药物组对Hela细胞活性的增殖抑制作用的能力,得出的结果是瘤背石磺各药物组对Hela细胞活性均有抑制作用,但是瘤背石磺原多糖的抑制能力明显低于另外结构改变的三组瘤背石磺多糖,而且随着多糖浓度的增加,抑制作用有显著或极显著的提高,而且经修饰后的瘤背石磺多糖组的细胞活性显著低于瘤背石磺原多糖组,从而证实了瘤背石磺多糖有抗肿瘤活性。而且多糖的结构修饰有助于提高抗肿瘤活性。为探究瘤背石磺多糖促细胞凋亡作用的阻滞周期,运用流式细胞仪检测细胞周期,发现各OSP组将Hela细胞阻滞在G1期,根据药物浓度的增加,Hela细胞G1/S期的比值显著增加。验证了瘤背石磺多糖的抗肿瘤作用,而且也验证了多糖结构的改变对其抗肿瘤活性的影响是很大的。3、瘤背石磺多糖促使Hela细胞凋亡的分子机制的初步研究经过细胞活性的验证仅仅证明了瘤背石磺多糖是具有抗肿瘤活性的,而且其结构的改变会对抗肿瘤活性产生很大的影响。但是,具体是如何发挥抗肿瘤作用的分子机制才是本研究的最重要的一点,也是多糖作为抗肿瘤药物的研发不可缺失的探究。本研究利用RT-q PCR和Western blot进行瘤背石磺多糖诱导Hela细胞凋亡的分子机制。通过对抗凋亡基因和蛋白Bc L-2、Bc L-x L以及促凋亡基因和蛋白Casepase-3的基因水平和蛋白水平的表达量测定,结果发现,随着各组瘤背石磺多糖浓度的增加,促凋亡基因和蛋白Casepase-3的表达量呈显著或极显著增加,而在中、低浓度下的抗凋亡基因和蛋白Bc L-2和Bc L-x L无显著变化,特别是在瘤背石磺原多糖的处理下,表达量明显无变化,但是在磷酸化和乙酰化修饰的瘤背石磺多糖处理下,抗凋亡基因和蛋白Bc L-2和Bc L-x L会随着浓度的变化表达量有一定的增加但是远远低于促凋亡基因和蛋白Casepase-3的表达量,此结果说明瘤背石磺多糖可以通过调节Casepase信号机制从而发挥抗肿瘤活性,但是并不一定只有这一个途径,这是以后值得深入探究的问题。