CD133(prominin-1)是一种局限性分布于胞浆膜的突出处,如上皮微绒毛、附睾导管上皮的硬纤毛处的糖蛋白,因此根据拉丁文prominere,取名为prominin.1997年,Yin等首次报道了一个新的造血干/祖细胞(HSPC)表面抗原AC133并制备了该抗原的单克隆抗体,2000年6月由国际白细胞分化抗原工作组会议(ILDAW)命名为CD133。CD133分子在蛋白结构上不同于4次跨膜(4-TM)和7次跨膜(7-TM)受体家族成员,它是5次跨膜(5-TM)受体家族中的第一个成员,分子量约为120kDa,其分子转录由5个不同的启动子控制。CD133分子具有胞外的氨基末端和胞内的羧基末端,以及胞外的8个一样的N-糖基化位点。CD133的分子结构和蛋白表达的特点提示它可能是作为生长因子受体发挥生物学作用。此外,有12个不同氨基酸序列的prominin-1剪接体相继在啮齿类和灵长类被发现。CD133分子在干/祖细胞表达并随细胞分化快速下调,该特点使之成为内皮、脑、骨髓、肝脏、肾脏、前列腺、胰腺和包皮等组织检测和分离干/祖细胞的标记分子。此外,除了在正常组织表达外,在白血病细胞、脑胶质瘤、结肠癌、前列腺癌、肝癌和胰腺癌中也能检测到CD133分子的表达。已有的研究结果表明CD133~+肿瘤细胞具有很强的自我更新、增殖能力强和多向分化的潜能,提示CD133是研究肿瘤干细胞的重要靶分子之一。同时还有研究显示CD133分子可能在肿瘤免疫逃逸、药物耐受以及放疗抵抗中发挥了重要作用。人CD133有2种亚型,继Yin克隆并鉴定了CD133-1后Yu等克隆出CD133-2,并发现与CD133-1仅在胎脑和骨骼肌中呈优势表达特性不同,CD133-2在许多胎儿组织和成熟组织中呈优势性表达,并在一些肺癌、前列腺癌、结肠癌和乳腺癌细胞株中也有表达。两种异构体的表达谱不同,它们的功能是否有差异目前尚不清楚。虽然,自CD133分子发现后的10多年来一直为广大科研工作者所关注,但研究CD133分子的手段尚缺乏,特别是与其相互作用的分子尚未克隆,CD133的生物学功能及参与的信号通路至今尚不清楚。目前使用的商品化抗CD133抗体(293C3,AC133,AC141,Miltenyi Biotec)在运用中存在一定的局限性(主要针对该分子的糖基化位点,故糖基化水平的变化影响直接影响了CD133检测到的表达水平)。因此,研制抗人CD133功能性单克隆抗体将有助于揭示CD133的生物学功能,研究该分子在肿瘤发生、发展中作用机制,也为肿瘤干细胞的研究提供了一种新的手段。本论文旨在通过克隆人CD133-2全长基因构建稳定表达CD133-2的L929转基因细胞,研制鼠抗人CD133-2单克隆抗体,并对其生物学特性进行初步研究;同时初步探讨CD133-2分子在肺癌中的表达及其临床意义。第一部分人CD133-2基因转染细胞株的构建以及生物学功能的初步研究【目的】克隆人CD133-2基因编码区全长基因,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP-CD133-2,获得稳定表达CD133-2基因的转基因细胞并初步研究其对T细胞的体外生物学作用。【方法】通过重叠PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出CD133-2的全长编码区cDNA,并克隆入pMDT-18载体中,双酶切后装入真核表达载体p IRES2-EGFP中,通过脂质体法转染L929细胞,经G418抗性筛选出稳定表达CD133-2分子的L929细胞株;采用RT-PCR、Western-blot和流式细胞仪等分析鉴定CD133-2分子的表达;采用MTT、流式细胞术和ELISA等初步观察CD133-2基因转染细胞对T细胞体外生物学功能的影响。【结果】成功克隆出CD133-2全长编码区基因,构建了含人CD133-2基因的重组真核表达载体,并获得能稳定高表达人CD133-2分子的L929转基因细胞,初步功能学研究结果提示,CD133-2转基因细胞可能具有体外抑制T细胞增殖的作用。【结论】成功建立了可稳定高表达人CD133-2膜型分子的基因转染细胞,为研制抗人CD133-2单克隆抗体提供了有效的免疫原,也为进一步研究CD133-2分子生物学功能提供了有价值的工具。第二部分鼠抗人CD133-2单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究【目的】研制鼠抗人CD133-2单克隆抗体,分析人CD133-2分子在肿瘤细胞上的表达,并对其生物学特性进行初步探讨。观察单克隆抗体对CD133-2表达的肿瘤细胞系U937和SW480的体外生物学作用,为抗体用于肿瘤干细胞研究提供必备的物质手段和实验依据。【方法】以高表达人CD133-2分子的基因转染细胞L929/CD133-2为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术,将免疫小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞株SP2/0融合,以CD133-2的基因转染细胞和表达CD133-2的视网膜母细胞瘤细胞株WERI-Rb1和Y79为抗原筛选阳性细胞,L929/mock细胞为抗原阴性筛选细胞;经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,获得2株特异分泌鼠抗人CD133-2分子单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig亚型快速定性试纸法、竞争结合抑制以及Western blot等试验,对获得的杂交瘤细胞株及单克隆抗体进行生物学特性的鉴定;用间接免疫荧光法初步分析单抗对不同来源人肿瘤细胞株的结合反应;免疫组织化学方法分析胚胎组织和胎盘组织中CD133-2分子的表达;观察CD133单克隆抗体对髓性白血病细胞株U937和结肠癌细胞株SW480的体外生物学效应,包括:苔盼蓝活细胞计数、CCK8、集落形成实验分析U937细胞的增值;PI染色和流式细胞术分析细胞周期分布。【结果】成功获得2株持续、稳定分泌鼠抗人CD133-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为6B3和9G4。经过快速定性试纸分析显示,2株单抗轻链均为κ链,重链均为IgG2b亚类;Western blot结果显示6B3和9G4均能和CD133-2/L929和WERI-Rb1细胞的蛋白结合,特异性识别和结合约120kDa的蛋白;免疫组织化学试验显示6B3能特异性结合6周胚胎的大脑皮层组织、肝脏组织和肾脏组织。在胎盘组织的绒毛上皮细胞中亦有表达。竞争结合抑制实验显示2株抗体间不产生竞争作用。对mAb生物学特性的研究结果表明,2株mAb均能识别U937、THP-1、SW480、WERI-Rb1和Y79等肿瘤细胞株表面的CD133-2分子。活细胞计数和CCK-8检测显示,单抗6B3可以促进细胞株U937和SW480的体外增殖,并呈一定的剂量依赖性效应。此外,单抗6B3能增加U937细胞集落的形成,使U937细胞S期增加。单抗9G4没有类似的作用。【结论】成功获得2株稳定分泌特异性鼠抗人CD133-2单抗的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体与商品化抗人CD133-2单抗识别不同的抗原表位。免疫荧光标记和流式细胞分析显示,CD133-2分子在一些肿瘤细胞株表达。免疫组化分析表明CD133-2分子在胚胎组织和胎盘组织中有表达。单抗6B3可以促进CD133-2表达的U937和SW480细胞株在体外的增殖。由此表明,CD133-2分子不仅仅是细胞膜表面的一种标记分子,它具有其特定的生物学功能。单抗6B3是一株激发型的抗人CD133-2的功能性抗体,该抗体的获得为探讨CD133-2分子的表达谱及CD133-2的生物学功能提供了有价值的研究工具。第三部分CD133-2在肺癌中的表达及其临床意义【目的】研究非小细胞肺癌(NSCLC)组织中CD133-2分子的表达及其临床意义。【方法】通过免疫组织化学技术分析NSCLC组织103例、癌旁组织25例和肺部良性病变组织24例中CD133-2的表达,并结合临床资料,采用病例对照设计统计分析CD133-2的表达与非小细胞肺癌患者临床特征之间的关系。【结果】免疫组织化学结果显示,NSCLC组织中CD133-2分子的表达与肿瘤细胞分化程度有关(P＜0.01),与抑制性免疫调节分子B7-H4的表达存在一定相关性(P＜0.01)。COX风险分析显示:单因素和多因素分析都显示CD133-2是非小细胞肺癌患者长期生存率的独立风险因素(危险系数4.202,P＜0.001)。【结论】本研究发现人非小细胞肺癌组织中有CD133-2的表达,并与肺癌细胞分化程度相关。此外,我们还发现肺癌组织中CD133-2的表达与抑制性协同刺激分子B7-H4的表达呈正相关。该研究为揭示CD133-2在肺癌发生、发展中的作用提供了新的线索。综上所述,本课题通过克隆人CD133-2全长基因,构建基因转染细胞株L929/CD133-2;以L929/CD133-2为免疫原免疫小鼠研制获得2株特异性鼠抗人CD133-2单克隆抗体6B3和9G4;进一步对单抗的生物学特性进行研究证实单抗6B3为激发型单抗,能在体外促进CD133-2表达的细胞株U937和SW480的增殖。同时,通过免疫组织化学检测了非小细胞肺癌组织中CD133-2分子的表达,并通过统计学分析了CD133-2表达与负性协同刺激分子B7-H4的表达及其与临床资料的相关性,为肿瘤的免疫治疗提供了新的靶点和策略。