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背景:随着生活方式改变,心血管病的发病率呈逐年上涨趋势。心室重构是心血管疾病发生发展的必经之路,它是由多种损伤因素共同参与的结果,其中NF-κB介导的炎症反应是重要一环。心脏组织是由心脏细胞及细胞外间质共同组成,在心室重构过程,心脏细胞中的心肌成纤维细胞起着重要作用。G蛋白偶联受体(TGR5)作为一种胆汁酸膜受体,在多种组织、器官上均有表达,对机体的能量代谢、免疫调控等反应过程起着重要的作用。已有研究表明在单核-巨噬细胞[1,2]、胆道上皮细胞[3]、胃[4]等组织细胞膜上TGR5激动可减轻NF-κB介导的炎症反应。但目前尚无相关研究明确TGR5激动对心肌成纤维细胞的影响。目的:探究G蛋白偶联受体(TGR5)激动对血管紧张素II诱导的乳小鼠心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)增殖的影响,并探讨可能存在的机制。方法:1、乳小鼠CFs的培养与鉴定:使用酶消化及差速贴壁法培养CFs,免疫荧光鉴定CFs。2、检测TGR5 mRNA在乳小鼠CFs的表达量:使用RT-PCR法检测CFs及心脏、肝脏、脾脏组织上TGR5mRNA表达量。3、TGR5过表达病毒制备与检测。4、检测TGR5病毒对CFs的感染效率:实验设置为(1)实验组:CFs-v+培养基组、CFs-v+Polybrene组、CFs-v+ENi.S组、CFs-v+Polybrene+ENi.S组(CFs-v指成功感染TGR5过表达病毒的CFs,“+”指阳性病毒,“-”指阴性病毒);(2)对照组:CFs+培养基组、CFs+Polybrene组、CFs+ENi.S组、CFs+Polybrene+ENi.S组。5、检测TGR5过表达病毒感染后的CFs上TGR5 mRNA的表达情况:使用RT-PCR法检测CFs、CFs-v(+)、心脏、肝脏、脾脏组织上TGR5 mRNA表达量。6、检测血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ)、TGR5过表达病毒对CFs增殖的影响:(1)Ang Ⅱ实验分组设置为空白对照组:CFs+Ang II(0mol/L)组,Ang II干预组:CFs+Ang Ⅱ(10-5mol/L)组、CFs+Ang II(10-6mol/L)组、CFs+Ang Ⅱ(10-7mol/L)组;(2)TGR5实验组设置为对照组:Ang Ⅱ+CFs组,病毒干预组:Ang Ⅱ+CFs-v(+)组、Ang Ⅱ+CFs-v(-)组,使用MTT法检测各组经不同实验条件干预后在不同时间点的OD值,计算细胞相对增殖或抑制率。7、检测过表达TGR5及激动TGR5后对CFs增殖的影响:实验分组为(1)CFs组;(2)CFs-v(+)组;(3)Ang Ⅱ+CFs-v(+)组;(4)Ang Ⅱ+CFs-v(-)组;(5)Ang Ⅱ+CFs-v(+)+诺米林(TGR5激动剂)组;(6)Ang Ⅱ+CFs-v(-)+诺米林组,使用MTT法检测各实验组干预不同时间后的增殖情况,使用Western Blot技术检测各实验组TGR5、P65蛋白的相对表达量,使用ELISA技术检测各实验组的c AMP、胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ含量。结果:1、CFs培养成功,荧光免疫法检测CFs纯度大于90%。2、RT-PCR结果:正常情况下TGR5 mRNA在乳小鼠CFs上的表达量极少,CFs组TGR5 mRNA表达量明显少于心脏组、肝脏组、脾脏组,显著差异(P<0.05);CFs-v(+)组TGR5 mRNA表达量较CFs组明显升高,P<0.05。3、MTT结果:不同浓度的Ang Ⅱ对CFs均具有促增殖作用,Ang Ⅱ+CFs组的促增殖作用明显强于CFs组(P<0.05),而10-7mol/L Ang Ⅱ诱导24小时的促进增殖作用最强。感染TGR5过表达病毒后,与CFs组抑制细胞增殖作用比较,CFs-(+)组抑制细胞增殖作用明显增强,P<0.05。激动TGR5后,与Ang II+CFs-v(+)组抑制细胞增殖作用比较,Ang Ⅱ+CFs-v(+)+诺米林组的抑制细胞增殖作用明显增强,P<0.05;4、Western Blot结果:(1)感染TGR5后,与CFs组比较,CFs-v(+)组、Ang Ⅱ+CFs-v(+)组、Ang Ⅱ+CFs-v(+)+诺米林组上的TGR5蛋白表达量均明显增高,P<0.05;(2)感染TGR5病毒后,与CFs组比较,CFs-v(+)组上的P65蛋白表达量明显减少,P<0.05;激动TGR5后,与Ang Ⅱ+CFs-v(+)组比较,Ang Ⅱ+CFs-v(+)+诺米林组的P65蛋白表达量明显减少,P<0.05。5、ELISA结果:(1)感染TGR5病毒后,与CFs-v组比较,CFs-v(+)组胞浆中c AMP浓度明显升高,P<0.05;激动TGR5后,与Ang Ⅱ+CFs-v(+)组比较,Ang Ⅱ+CFs-v(+)+诺米林组胞浆中c AMP浓度较高,P<0.05。(2)Ang Ⅱ诱导后,与CFs-v(+)组比较,Ang Ⅱ+CFs-v(+)组细胞合成分泌的胶原蛋白I/III量增多,P<0.05;感染TGR5病毒后,与CFs组比较,CFs-v(+)组细胞合成分泌的胶原蛋白I/III量减少;激动TGR5后,与Ang Ⅱ+CFs-v(+)组比较,Ang II+CFs-v(+)+诺米林组细胞合成分泌的胶原蛋白Ⅰ/Ⅲ量明显减少,P<0.05。结论:1、TGR5 mRNA在小鼠CFs上的表达量极少。2、激动TGR5,可通过增加胞浆中c AMP,减少P65核转位。3、激动TGR5能抑制Ang Ⅱ诱导的CFs增殖及胶原蛋白分泌,其可能机制是通过NF-κB信号通路抑制Ang Ⅱ诱导的CFs增殖及胶原蛋白分泌。