类胡萝卜素及其衍生物不仅是许多抗逆物质生物合成的前体物,而且还调控植物花色、香气风味等,广泛应用于医药、卫生、食品、保健等行业。类胡萝卜素的裂解受类胡萝卜素裂解双加氧酶(carotenoid cleavage dioxygenase,CCDs)调控。CCDs是植物体内类胡萝卜素裂解代谢途径中的关键酶,含有9个成员,其中CCD1的调控机制最为复杂。为了深入研究桂花OfCCD1基因在香气生物合成中的生理功能,本研究采用RACE-PCR技术克隆桂花的OfCCD1基因,并进行核酸序列、蛋白质序列的分析,了解其结构特点;利用半定量PCR方法研究OfCCD1基因表达模式与含量变化,明确其表达规律;采用原核表达的方法进行诱导、纯化CCD1蛋白质,鉴定其氧化酶活性;利用叶盘法转化法和花序浸染法转化烟草和拟南芥,揭示其生理功能,取得如下实验结果:1、核酸序列分析结果表明,桂花OfCCD1基因的完整开放读码框(ORF)长度为1632 bp,编码的蛋白质序列含有543个氨基酸,分子式为C2785H4294N7200791S24,相对分子质量约为61288.52,理论等电点为6.27,脂溶指数80.77,总平均疏水指数为-0.262。其二级结构主要由α-螺旋(11.60%)、无规则卷曲(58.38%)、延伸链(23.76%)和β-转角(6.26%)组成,其蛋白质三维结构与玉米中的同源蛋白质VP14相似度最高;2、金桂、银桂、丹桂和四季桂OfCCD1基因均在香眼期时表达水平最低,依次在盛花初期、盛花中期、盛花中期和盛花初期时达到峰值,表明OfCCD1基因的表达丰度因桂花种类的不同而存在差异性表达,且具有时空特异性;3、0.5 M浓度的IPTG可以诱导OfCCD1蛋白的表达,通过镍柱纯化可以得到目的蛋白,分子量约为64KDa;同时利用His抗体进行鉴定,可以观察到目的条带,大小与目的蛋白相符合;4、采用叶盘法转化烟草植株,通过抗性筛选获得了抗性转基因植株,同时利用半定量PCR进行检测,可以扩增到OfCCD1基因;采用花序浸染法转化拟南芥植株(Col-0),获得了 OfCCD1过表达的阳性植株,为进一步研究OfCCD1的生理功能奠定了基础。