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目的: 1.探究miR-296-5p,miR-451及miR-210在肝癌细胞生长等方面的作用及潜在靶点,并为研究其相关机制和以阻断其靶基因为基础的靶向治疗提供实验基础。 2.明确miR-296-5p,miR-451与miR-210在肝癌诊断和预后中作为生物标记物的作用,为进一步深入研究其作用机制提供现实的临床依据。 方法: 1.通过荧光显微镜观察GFP表达以及qRT-PCR实验,检测细胞转染后HepG2肝癌细胞株中miR-296-5p,miR-451及miR-210的表达情况; 2.通过CCK-8实验、平板克隆形成实验、流式细胞术细胞周期检测等细胞学实验验证miR-296-5p,miR-451及miR-210对肝癌细胞生长增殖、细胞周期阻滞等方面的作用; 3.通过miRWalk、miRanda、RNA22与Targetscan在线软件对miR-296-5p, miR-451与miR-210进行靶基因预测并选择合适的靶基因构建GLO质粒。 4.通过双荧光素酶报告基因实验或Western Blot实验验证miR-296-5p, miR-451和miR-210可能的靶基因; 5.通过t检验和HCL分层聚类对375名肝癌确诊患者和37名正常对照中1042种miRNAs的表达量数据资料统计分析得出一组差异表达性miRNAs,并通过ROC曲线方法和Kaplan-Meier生存曲线分析判断miR-296-5p,miR-451及miR-210在肝癌诊断及预后方面的作用。 结果: 1.荧光显微镜下GFP表达量以及qRT-PCR实验结果显示miR-296-5p、miR-451与miR-210的表达质粒构建成功并且细胞转染效率良好。 2. CCK-8实验结果显示上调miR-296-5p和miR-451以及下调miR-210的表达可抑制HepG2肝癌细胞活力。 3.平板克隆集落形成实验结果显示上调miR-296-5p和miR-451以及下调miR-210的表达可抑制HepG2肝癌细胞增殖和克隆形成。 4.流式细胞术检测细胞周期结果显示上调miR-296-5p和miR-451以及下调miR-210的表达可抑制HepG2肝癌细胞于S期。 5.双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-296-5p对MAPK8IP2基因有明显调控作用,而对SAPCD2、SYT13、TBX2和TFEB基因未见明显调控作用。同时, miR-451对MIF和CDKN2B基因以及miR-210对FLNC基因亦无明显调控作用。 6. Western blot实验结果显示miR-296-5p在HepG2肝癌细胞中对JIP-2蛋白调控作用不甚明显。 7. T检验发现肝癌患者中有206种差异表达性miRNAs具有统计学意义,其中包括miR-296,miR-451和miR-210;HCL聚类分析发现33种miRNAs的差异表达标签可有效区分出肝癌组织和非癌组织;ROC曲线方法和Kaplan-Meier曲线分析显示miR-451在肝癌的诊断及预后方面有良好的作用。 结论: MiR-296-5p、miR-451表达上调以及miR-210表达下调可有效抑制HepG2肝癌细胞的生长增殖,阻滞细胞周期于S期。MiR-296-5p在HepG2肝癌细胞中对MAPK8IP2在基因水平的调控作用显著,但在蛋白水平不甚明显。此外, miR-451被验证可能是肝癌诊断和预后非常有效的生物标志物。