随着经济社会的发展,医疗水平的提高,我国人口平均寿命不断提高,老龄人口的比例逐年增加,针对这一庞大的特殊人群,研究血管衰老,即随增龄心血管系统发生的结构和功能的特征性改变,已成为刻不容缓的问题。研究发现,血管衰老与各种心血管疾病相互作用,影响了疾病的发生的阈值、严重程度和预后,有望成为临床防治心血管病的新靶点。血管衰老的重要特点之一为血管壁弹性的下降和僵硬度的增加,而血管外膜及外膜成纤维细胞(adventitial fibroblasts, AF)具有重要的免疫及内分泌功能,在分泌胶原等细胞外基质,维持血管弹性等方面发挥着关键的作用,可能成为血管衰老研究的新的突破口。课题组前期已经对血管内皮细胞、平滑肌细胞的衰老规律及益气活血中药的作用机制进行了探讨。本研究在此基础上,以血管外膜为切入点,以血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶p47phox、活性氧(reactive oxygen species,ROS)通路为主线,从动物、细胞、分子水平探讨血管衰老的机制,观察益气活血中药(人参三七川芎提取物)延缓血管衰老的作用,进一步探讨其作用机制。同时,通过临床调查,初步探讨血管衰老的中医证型特点。以期通过本研究,为血管衰老的中医药研究奠定基础,为临床运用中医药延缓血管衰老提供科学依据。本研究分为三个部分：文献综述、基础研究和临床研究。1.文献综述通过对血管外膜及AF相关文献的归纳,综述了血管外膜和AF在血管疾病发生发展过程中的作用。2.基础研究由以下三个基础实验构成：实验一：益气活血中药延缓自然衰老大鼠血管外膜重构的实验研究目的：观察自然衰老大鼠血管外膜的病理改变并探讨其机制；观察益气活血中药(人参三七川芎提取物)对衰老血管外膜病变的干预作用,并探讨其作用机制。方法：建立自然衰老大鼠模型,分为衰老模型组(蒸馏水)、中药高剂量组(人参、三七、川芎醇提物1493.4mg/kg/d)、中药中剂量组(人参、三七、川芎醇提物746.7mg/kg/d),中药低剂量组(人参、三七、川芎醇提物373.4mg/kg/d)、氯沙坦对照组(10mg/kg/d),另设一青年对照组(蒸馏水)。给予相应干预15周后,采用Morris水迷宫自主活动法观察动物的学习能力、记忆获取能力和记忆保存能力,HE染色法观察胸主动脉壁形态,苦味酸天狼猩红染色法观测血管壁胶原种类、分布和含量,扫描电子显微镜观察外膜超微结构,放射免疫分析法检测血浆肾素活性(plasma renin activity, PRA)、血浆Ang Ⅱ浓度及外膜组织Ang Ⅱ含量,生物化学分析法检测外膜组织羟脯氨酸、抗超氧阴离子自由基(superoxide anion, O2)活力单位含量,酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测外膜组织1型基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases type1, MMP-1)及其抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase type1, TIMP-1)含量,RT-PCR法检测外膜组织血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ receptor1, AT1R)、血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱ receptor2, AT2R)和NADPH氧化酶p47phox的mRNA含量,western bloting法检测外膜组织AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox蛋白表达。结果：与青年组比较,衰老模型组血管外膜外膜增厚,AF增生,外膜厚度/管径增高,胶原分布致密,胶原纤维堆积,粗大,排列紊乱,外膜组织Ⅰ型胶原增加,Ⅲ型胶原减少,Ⅲ型胶原/Ⅰ型胶原降低,羟脯氨酸含量增高,MMP-1含量降低,TIMP-1含量增高,MMP-1/TIMP-1降低,02-合成增加,Ang Ⅱ含量增高,AT1R的mRNA及蛋白表达下调,AT2R及NADPH氧化酶p47phox的mRNA及蛋白表达上调,动物的学习能力、记忆获取能力和记忆保存能力下降。人参三七川芎提取物能够改善衰老血管形态学改变,抑制AF过度增殖,改善胶原比例紊乱,降低外膜组织中Ang Ⅱ的水平,抑制02合成,调节MMP-1/TIMP-1平衡,从mRNA及蛋白水平上调AT1R及AT2R的表达,下调NADPH氧化酶p47phox的表达,改善动物学习能力、记忆获取能力和记忆保存能力。结论：衰老血管出现外膜重构,表现为外膜增厚,AF过度增殖,MMP-1/TIMP-1平衡失调,胶原堆积,Ⅰ型、Ⅲ型胶原比例紊乱等,其机制可能与AngⅡ、NADPH氧化酶p47phox、活性氧(ROS)通路有关；人参三七川芎提取物可能通过对外膜局部Ang Ⅱ、AT1R等多靶位的干预,改善外膜重塑,增加血管弹性,进而延缓血管衰老,提高整个机体的状态。实验二：益气活血中药延缓AF复制性衰老的实验研究目的：观察AF复制性衰老的病理变化,观察益气活备中药(人参三七川芎提取物)延缓AF复制性衰老的作用,并探讨其机制。方法：采用原代培养的方法,通过传代建立复制性衰老AF模型,分为衰老模型组(DMEM完全培养液),中药高剂量组(100m/L人参三七川芎提取液+DMEM完全培养液),中药低剂量组(50mg/L人参三七川芎提取液+DMEM完全培养液),VitE组(100mg/LVitE+DMEM完全培养液),另设一5代空白组(DMEM完全培养液)。采用细胞衰老特异性β半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase, SA-β-gal)染色法观察细胞衰老改变,噻唑兰(MTT)比色法分析细胞增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期,免疫细胞化学染色法检测细胞内MMP-1及TIMP-1含量,荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)含量,生物化学法检测培养液内抗O2-活力单位含量,ELISA法检测培养液内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量,RT-PCR法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox的mRNA含量,western bloting法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox蛋白表达。结果：衰老AF SA-β-gal染色阳性率增加,G1期细胞减少,MMP-1表达降低,TIMP-1表达增加,细胞内ROS荧光强度增加,O2-合成增加,Ⅰ胶原浓度升高,Ⅲ型胶原浓度降低,AT1R mRNA及蛋白表达下调,AT2R、NADPH氧化酶P47phox的mRNA及蛋白表达上调。人参三七川芎提取物干预后,AF的SA-p-gal染色阳性率降低,G1期细胞增加,MMP-1表达增加,TIMP-1表达降低,细胞内ROS荧光强度减弱,O2-合成减少,Ⅰ胶原浓度降低,Ⅲ型胶原浓度升高,AT1R和AT2R的mRNA及蛋白表达上调,NADPH氧化酶P47phoxmRNA及蛋白表达下调。结论：衰老AF SA-β-gal染色阳性表达增加,MMP-1/TIMP-1合成失衡,胶原分泌紊乱,病变特点与衰老动物一致,可能是衰老血管外膜重构病理过程的参与者；人参三七川芎提取物可能从mRNA及蛋白水平下调NADPH氧化酶p47phox的表达,减少ROS合成,从而降低SA-β-gal染色阳性表达,调节MMP-1/TIMP-1平衡,调节胶原代谢,进而改善血管重构,延缓血管衰老。实验三：益气活血中药对Ang Ⅱ诱导的AF增殖及胶原生成等相关因素的影响目的：观察Ang Ⅱ对AF的作用,并探讨其机制；观察益气活血中药(人参三七川芎提取物)对Ang Ⅱ诱导的AF病理变化的影响,并探讨其作用机制。方法：采用原代培养的方法,建立Ang Ⅱ诱导的AF模型,分为空白对照组(DMEM完全培养液)、Ang Ⅱ诱导模型组(10-6mol/L Ang Ⅱ+DMEM完全培养液)、中药高剂量组(10-6mol/L Ang Ⅱ+100mg/L人参三七川芎提取液+DMEM完全培养液)、中药低剂量组(10-6mol/L Ang Ⅱ+50mg/L人参三七川芎提取液+DMEM完全培养液)、Valsartan组(10-6mol/L Ang Ⅱ+10-6mol/LValsartan+DMEM完全培养液)。采用SA-β-gal染色法观察细胞衰老改变,噻唑兰(MTT)比色法分析增殖情况,流式细胞仪分析细胞周期,免疫细胞化学染色法检测细胞内MMP-1及TIMP-1含量,荧光探针法检测细胞内ROS含量,生物化学法检测培养液内抗O2-活力单位含量,ELISA法检测培养液内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原含量,RT-PCR法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox的mRNA含量,western bloting法检测细胞AT1R、AT2R和NADPH氧化酶p47phox蛋白表达。结果：经Ang Ⅱ诱导后,AF的SA-β-gal阳性染色率增加,S期细胞增多,MMP-1表达降低,TIMP-1表达增加,ROS荧光强度增强,02-合成增加,Ⅰ胶原浓度升高,Ⅲ型胶原浓度降低,AT1R mRNA及蛋白表达下调,AT2R和NADPH氧化酶p47phox mRNA及蛋白表达上调。人参三七川芎提取物干预后,AF的SA-β-gal阳性染色率降低,G1期细胞增多,MMP-1表达增加,TIMP-1表达降低,ROS荧光强度减弱,02-合成下降,Ⅰ胶原浓度降低,Ⅲ型胶原浓度升高,AT1R和AT2RmRNA及蛋白表达上调,NADPH氧化酶p47phox mRNA及蛋白表达下调。结论：Ang Ⅱ对AF具有促进增殖和SA-β-gal染色阳性表达,诱导胶原分泌紊乱,破坏MMP-1/TIMP-1合成平衡等作用,人参三七川芎提取物可能经由AT1R从mRNA及蛋白水平下调NADPH氧化酶p47phox的表达,减少ROS合成,从而拮抗Ang Ⅱ对AF的不良刺激,抑制细胞增殖,调节MMP-1/TIMP-1平衡,调节胶原代谢,进而改善血管重构,延缓血管衰老。3.临床研究：血管衰老的中医证型特征研究目的：观察血管衰老的中医证型特点。方法：选择231例原发性高血压患者作为研究对象,利用聚类分析和主成分分析的统计学方法,分析其血管衰老相关指标及中医四诊信息。结果：高血庄合并血管衰老的主要证型为血.瘀证、气虚证、阴虚证,可兼见痰浊及肝阳上亢证候；高血压血管衰老病变发展至动脉粥样硬化时,其主要证型为痰浊证、血瘀证、气虚证,可兼见阴虚及阴阳两虚证候。结论：血瘀证和气虚证贯穿高血压血管衰老发生发展始终,益气活血延缓血管衰老有据可循。本研究创新点(1)本研究从血管研究的新热点——血管外膜入手,以AngⅡ、NADPH氧化酶p47phox、ROS通路为主线,研究益气活血中药延缓衰老作用及机制,是该领域的独创性研究。(2)本研究建立相关的AF模型,首次从成纤维细胞角度进行血管衰老研究。(3)本研究采用聚类分析、主成分分析的统计学方法分析血管衰老相关指标和中医四诊信息,从而阐明血管衰老的中医证型特点,经文献检索未见相关报道。