经典名方作为中药方剂的杰出代表,是中医药传承和创新的有效载体,至今在临床仍广泛应用,独具特色和优势。近10年来国家先后发布了一系列鼓励性政策,支持促进中医经典名方的研发。经典名方的核心生命力在于临床疗效,借助现代技术手段为经典名方的临床精准定位提供支持和参考,以指导其临床更合理、有效的应用,是经典名方研究的重要内容之一。目前,针对经典名方的临床应用研究已开展了文献研究、临床经验挖掘研究、借助现代技术手段的机制研究、循证评价研究等,但相关研究方法仍较为分散,尚未形成系统的研究模式和思路。以经典名方苓桂术甘汤为例,其文献计量学研究显示:苓桂术甘汤在遵从《伤寒杂病论》原始主治记载的同时,临床应用范围不断扩展,目前可用于心血管系统、神经系统、消化系统等多系统疾病的治疗中;但仍存在着针对同一应用领域的研究切入点较少、研究不够深入,临床与基础研究成果未能形成有效互动等问题,仍有必要开展进一步的系统研究。近年来,随着多组学技术和大数据资源的迅速发展,人们对于机体和疾病的认知已由分解还原走向系统整合。整合药理学作为一门从多层次、多环节、多角度研究复杂系统间整合规律和作用原理的交叉学科,与中医学的整体观理念不谋而合。本研究即希望借鉴整合药理学的思路和方法,以苓桂术甘汤在代谢综合征脾虚湿盛证患者中的应用为切入点,开展经典名方苓桂术甘汤的整合系统研究,旨在为苓桂术甘汤临床精准应用及科学内涵阐释提供证据和支持,并为经典名方相关研究提供借鉴和参考。本研究包括两部分内容:第一部分为苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应特征研究,采用大样本、多中心、前瞻性病例系列研究设计,共纳入252例代谢综合征患者,苓桂术甘汤干预16周后全面收集相关数据资料,借助Logistic回归、分类树分析等数据统计挖掘方法,基于血糖、血脂、血压、腰围、胰岛素抵抗等代谢综合征各临床受益点,分析苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应人群特征,构建苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床决策路径,为苓桂术甘汤临床精准应用提供参考。第二部分为苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制研究,基于UPLC-MS检测、网络药理学、基础实验、代谢组学等技术方法,借鉴整合药理学思路,从“药物成分-通路预测-基础研究-临床研究”系统阐释苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制。第一部分:苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应特征探索性研究目的:基于代谢综合征各临床受益点,借助Logistic回归、分类树分析等数据统计挖掘方法,探索苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应人群特征,构建苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床决策路径,为苓桂术甘汤的临床精准应用提供参考。方法:采用大样本、多中心、前瞻性病例系列研究设计,在全国10余家分中心共招募252例符合条件的代谢综合征(脾虚湿盛证)患者,给予苓桂术甘汤治疗16周后,全面收集代谢综合征各组分相关数据资料,借助单因素分析、Logistic回归、分类树分析等数据统计挖掘方法,基于血糖、血脂、血压、腰围、胰岛素抵抗等代谢综合征各临床受益点,分析苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应人群特征,构建苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床决策路径。结果:1.苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应特征单因素分析结果合并TC水平较高的患者腰围改善更明显;合并体型较胖(表现为BMI、体重相对较大)、TC较高、饮食控制相对较好的患者血糖改善更明显;饮食运动控制相对较好的患者血压改善更明显;大龄患者合并较大腰围、较高的HDL-C、饮食控制相对较好时,血脂改善更明显;体重、腰围较大,收缩压较低,运动自我管理较好的青年代谢综合征患者,用药后血糖、血压、血脂综合受益更明显。2.苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床效应特征多因素分析结果具有头晕目眩、白腻苔等中医症状的患者用药后腰围改善更明显;合并TC异常的患者用药后血糖改善更明显;苓桂术甘汤对于收缩压较高的MS患者血压改善更明显,良好的饮食运动自我管理也有利于MS患者的血压改善;LDL-C水平较高的MS患者服用苓桂术甘汤后血脂及胰岛素抵抗改善更明显;具有较好的运动自我管理的年轻MS患者,若收缩压相对较高、无舌苔白腻的舌象表象,使用苓桂术甘汤后血糖、血压、血脂综合获益更明显。3.苓桂术甘汤用于代谢综合征的临床决策路径构建(1)基于胰岛素抵抗受益的临床决策路径构建:在下列情况下,代谢综合征患者使用苓桂术甘汤对于改善胰岛素抵抗受益较大:运动评分≥3.3分,且TG<2mmol/L,TC>5.1mmol/L,同时血压(收缩压)<135mmHg。运动评分≥3.3分,且TG≥2mmol/L,同时血压(收缩压)<141mmHg。模型预测准确率77.7%。(2)基于血糖受益的临床决策路径构建:在下列情况下,代谢综合征患者使用苓桂术甘汤对于改善血糖受益较大:年龄≥42 岁,腰围<91cm,TG≥1.3mmol/L,LDL-C≥3mmol/L。年龄<42 岁,TG≥1.9mmol/L。模型预测准确率68.0%。(3)基于血压受益的临床决策路径构建:在下列情况下,代谢综合征患者使用苓桂术甘汤对于改善血压受益较大:饮食评分<3.8分且TG<1.5mmol/L。饮食评分≥3.8分,运动评分<4.8分,空腹血糖<6.9mmol/L,糖化血红蛋白≥6.2%。饮食评分3.8分,运动评分≥4.8分,空腹血糖<6.9mmol/L。模型预测准确率57.3%。(4)基于血脂受益的临床决策路径构建:在下列情况下,代谢综合征患者使用苓桂术甘汤对于改善血脂受益较大:收缩压≥130mmHg且舒张压<87mmHg,体重<86kg,空腹血糖<6.4mmol/L,舌苔白腻。收缩压≥130mmHg,体重<86kg,无舌苔白腻。收缩压≥130mmHg,体重≥86kg,有饮酒史,年龄≥50岁。收缩压≥130mmHg,体重≥86kg,无饮酒史。收缩压<130mmHg。模型预测准确率55.3%。(5)基于腰围受益的临床决策路径构建:饮食评分≥2.5分,体重<71kg,年龄<47岁的代谢综合征患者使用苓桂术甘汤对于改善腰围受益较大。模型预测准确率92.2%。小结:1.基于血糖受益的苓桂术甘汤效应人群特征及决策路径苓桂术甘汤用于改善代谢综合征血糖异常时,需关注患者年龄及血脂情况,当患者年龄较小(<42岁)且合并血脂异常(TG≥1.9mmol/L)时,用药后血糖改善可能更显著。2.基于血压受益的苓桂术甘汤效应人群特征及决策路径良好的饮食运动自我行为管理(饮食评分≥3.8分,运动评分≥4.8分)对用药后血压改善具有积极的促进作用。而当患者同时合并有血糖、血脂异常(空腹血糖≥6.9mmol/L,TG≥1.5mmol/L)时,单独应用苓桂术甘汤治疗可能降压效果不佳,建议根据临床情况适当调整治疗方案。3.基于血脂受益的苓桂术甘汤效应人群特征及决策路径MS患者舌象表现为舌苔白腻时,使用苓桂术甘汤后血脂改善可能不明显。未合并高血压的MS患者(收缩压<130mmHg)用药后血脂改善可能更明显。4.基于腰围受益的苓桂术甘汤效应人群特征及决策路径苓桂术甘汤用于改善MS患者腰围异常时,可能更适用于已控制饮食的轻度肥胖的中青年患者(饮食评分≥2.5分,体重<71kg,年龄<47岁)。第二部分:苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制研究第一节基于代谢组学研究探索苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制本节包括基础代谢组学研究(研究一)与临床代谢组学研究(研究二),分别基于代谢综合征动物模型与临床患者,探索苓桂术甘汤干预前后的代谢组学特征,结合网络药理学预测结果,共同探索苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制。研究一基础代谢组学研究目的:联合采用UPLC/Q-TOF-MS检测方法与非靶向代谢轮廓分析技术,探索苓桂术甘汤干预代谢综合征模型大鼠的代谢组学特征。方法:本研究采用奥氮平诱导的胰岛素抵抗大鼠模型模拟临床代谢综合征疾病状态,治疗组同时分别给予低、中、高剂量苓桂术甘汤连续灌胃4周,末次给药后腹主动脉取血,分别用于生化检测及代谢组学分析。代谢组学样本常规制备,采用UPLC-QTof-MS进行检测,结果以raw.文件格式导出,使用simca 14.1软件进行PCA、OPLS-DA分析,确定差异性代谢产物;运用MetaboAnalyst在线分析平台对其进行通路分析。结果:(1)苓桂术甘汤干预4周后,与空白组相比,模型组体重、空腹血糖、血脂(TC、LDL-C、VLDL)、胰岛素抵抗指数均明显异常(p<0.05),表明造模成功;与模型组相比,苓桂术甘汤各剂量组在上述指标上均未见明显差异,但在苓桂术甘汤低剂量组可见对于TC、TG、VLDL、HSCRP具有一定的良性调节趋势。(2)苓桂术甘汤干预4周后,基于组间比较共鉴定出9种差异性代谢产物,其中溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine,LysoPE)3种、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)1 种、溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LysoPC)2 种、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)2种、神经酰胺(ceramide,Cer)1种。(3)所鉴定的差异性代谢物主要富集于4条代谢通路,其中最主要的通路为甘油磷脂代谢通路(Glycerophospholipid metabolism),其他还包括亚油酸代谢(Linoleic acid metabolism)、α-亚油酸代谢(alpha-Linolenic acid metabolism)、花生四烯酸代谢(Arachidonic acid metabolism)。研究二临床代谢组学研究目的:联合采用UPLC/Q-TOF-MS检测方法与非靶向代谢轮廓分析技术,探索苓桂术甘汤干预后,胰岛素抵抗受益的代谢综合征患者的代谢组学特征。方法:检测样本来源于中国中医科学院西苑医院及北京市昌平区中医院在临床研究中纳入的代谢综合征受试者,选取经苓桂术甘汤干预后胰岛素抵抗指数改善的受试者治疗前后血清样本,用于代谢组学检测。代谢组学样本制备方法、检测方法及数据处理分析方法同基础代谢组学部分。结果:基于胰岛素抵抗指数改善的受试者治疗前后血清样本代谢组学检测,共发现11种差异性代谢物,其中溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LysoPC)6 种、磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)4 种及左旋肉碱(L-Carnitine)。差异性代谢物主要富集于4条代谢通路,与基础代谢组学研究结果相同。第一节小结:代谢组学分析提示苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制可能与甘油磷脂代谢通路(Glycerophospholipid metabolism)相关。通过作用于该通路调节机体LysoPC及左旋肉碱含量水平,改善代谢综合征患者的代谢异常。第二节基于网络药理学研究探索苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制目的:结合UPLC/Q-TOF-MS测定技术及网络药理学研究方法,基于苓桂术甘汤主要测定成分进一步预测其用于代谢综合征的潜在靶点及作用通路,结合代谢组学研究结果,进一步探索苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制。方法:首先以“metabolic syndrome”或“insulin resistance”或“ICD-9:277.7”为关键词,在目前常用的疾病基因数据库中检索代谢综合征相关疾病靶标,结合STRING数据库及Cytoscape3.5.0软件构建并分析疾病靶标蛋白互作网络。其次,采用UPLC-MS技术联合UNIFI天然产物鉴定软件,对中药复方苓桂术甘汤饮片汤剂和颗粒剂分别进行检测,选取共有特征成分作为苓桂术甘汤的主要成分,采用CTlink化合物反向找靶软件预测苓桂术甘汤主要成分的作用靶标。再次,将代谢综合征疾病靶标网络与苓桂术甘汤药物靶标网络映射对接,构建“药物-疾病”靶标互作网络,获得苓桂术甘汤用于代谢综合征的药效成分及其效应靶标。最后,通过对苓桂术甘汤用于代谢综合征的效应靶标互作网络分析,确定关键效应靶标;通过对效应靶标KEGG通路富集分析,探索苓桂术甘汤用于代谢综合征的潜在作用机制。结果:(1)经常用的疾病基因数据库检索,共获得代谢综合征疾病相关靶标264个,其中 INS、AKT1、LEP、PPARG、IL6、TNF、SRC、EGFR、IGF1 为代谢综合征疾病关键靶标。(2)经UPLC/Q-TOF-MS测定苓桂术甘汤饮片汤剂和颗粒剂中共有成分20种,其中10种来源于甘草、4种来源于桂枝,5种来源于茯苓、1种来源于白术。(3)苓桂术甘汤20种主要成分可作用于634个靶点,将其与代谢综合征疾病靶标映射对接,显示苓桂术甘汤中14种成分可作用于38个代谢综合征疾病相关靶标,其中1个为代谢综合征疾病关键靶标。(4)通过对苓桂术甘汤用于代谢综合征的效应靶点互作网络分析,确定了8 个关键效应靶标,分别为:PTGS2、TNF、NR3C1、ESR1、PIK3R1、CYP19A1、ACE、IL2。(5)对苓桂术甘汤用于代谢综合征的效应靶标进行KEGG通路富集分析,共发现22条潜在作用通路,其中,脂肪细胞脂解调控通路(Regulation of lipolysis in adipocytes)可能与苓桂术甘汤的用于代谢综合征的作用机制最为密切。小结:苓桂术甘汤中14种主要成分可作用于38个代谢综合征疾病相关靶标,其中,PTGS2、TNF、NR3C1、ESR1、PIK3R1、CYP19A1、ACE、IL2为苓桂术甘汤干预代谢综合征的关键靶标;脂肪细胞脂解调控通路可能为苓桂术甘汤干预代谢综合征的主要通路作用。具体干预机制可能为参与空腹及进食状态下脂解调控过程,并通过干预PI3K及COX靶标位点分别对胰岛素信号通路与花生四烯酸炎症信号通路产生影响。结合网络药理学预测与代谢组学分析结果,推测苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制与干预脂肪细胞脂解调控通路及花生四烯酸通路有关,AdPLA(脂肪特异性磷脂酶A2)作为上述通路的共有组分或可介导苓桂术甘汤进一步参与甘油磷脂代谢通路,通过调节机体LysoPC及左旋肉碱含量水平,改善代谢综合征患者的代谢异常。总结1.基于代谢综合征各临床受益点,本研究数据分析结果提示苓桂术甘汤的临床适用人群为:(1)苓桂术甘汤用于改善代谢综合征血糖异常时,需关注患者年龄及血脂情况,当患者年龄较小(<42岁)且合并血脂异常(TG≥1.9mmol/L)时,用药后血糖改善可能更显著。(2)良好的饮食运动自我行为管理(饮食评分≥3.8分,运动评分≥4.8分)对MS患者用药后血压改善具有积极的促进作用。而当患者同时合并有血糖、血脂异常(空腹血糖≥6.9mmol/L,TG≥1.5mmol/L)时,单独应用苓桂术甘汤治疗可能降压效果不佳,建议根据临床情况适当调整治疗方案。(3)MS患者舌象表现为舌苔白腻时,使用苓桂术甘汤后血脂改善可能不明显。未合并高血压的MS患者(收缩压<130mmHg)用药后血脂改善可能更明显。(4)苓桂术甘汤用于改善MS患者腰围异常时,可能更适用于已控制饮食的轻度肥胖的中青年患者(饮食评分≥2.5分,体重<71kg,年龄<47岁)。(5)苓桂术甘汤可能更适用于表现为血脂异常、血糖异常及轻度肥胖的代谢综合征患者。当代谢综合征患者代谢异常组分中包括血压异常时,苓桂术甘汤的治疗效果可能不佳。2.苓桂术甘汤用于代谢综合征的作用机制可能与调控脂质及炎症相关通路有关:苓桂术甘汤可干预空腹及进食状态下的脂肪细胞脂解调控通路,并可通过干预COX靶标位点对花生四烯酸炎症信号通路产生影响,AdPLA作为上述通路的共有组分或可介导苓桂术甘汤进一步参与甘油磷脂代谢通路,通过调节机体LysoPC及左旋肉碱含量水平,改善代谢综合征患者的代谢异常。