1研究背景胃癌是全球第二大最常见的恶性肿瘤,根据最近的癌症统计,2011年全球新增胃癌病例为98.96万,死亡人数约73.8万,约占全部癌症死亡人数的1/10,严重影响人类生命健康。由于缺乏特异性的早期症状及初筛指标,90%的患者在就诊时已属于进展期。即使行标准的D2淋巴结清扫术后,术后局部复发率仍有19%-29%。化学药物治疗作为晚期胃癌的主要治疗方法,存在疗效差、全身毒副作用大等缺点,治疗效果和患者耐受性受到限制,因此,亟需研发新的胃癌治疗策略。血管生成是大多数实体肿瘤发生与进展的必要条件。Folkman等提出,实体瘤的生长过程中如果没有新生血管,肿瘤直径不会超过2～3mm。目前认为肿瘤血管形成与以下机制有关：(1)肿瘤血管生成因子产生过多,与肿瘤血管抑制因子失衡,导致内皮细胞激活,产生血管生成表型；(2)新生血管部位细胞外基质改变、基底膜降解,内皮细胞芽生、增殖和迁移；(3)新生内皮细胞索形成管状毛细血管袢及管腔;(4)新生血管管腔间的贯通。肿瘤新生血管的形成不仅为肿瘤的生长提供能量来源,也为肿瘤的转移提供通道。同时,不具备正常形态与功能的新生血管又可影响化学药物的转运和疗效。因此,抑制肿瘤血管生成成为胃癌研究的热点。Notch信号途径由一系列在进化过程中高度保守的蛋白组成,可直接调节细胞增殖、分化与凋亡等生物学行为。D114作为NotCh信号途径的五个配体之一,对血管生成发挥着决定性的调节作用。近年来的研究表明Notch信号途径不仅调控血管生成,也对肿瘤的进展发挥着重要作用,因而被认为是一个潜在的治疗靶点。有趣的是,NotCh信号途径在不同的实体瘤中可能起着截然不同的生物学作用。在胰腺癌、结肠癌、乳腺癌等大多数实体瘤中表现为致癌作用,而在部分皮肤癌、肺癌及前列腺癌中表现为抑癌作用。与其他实体瘤相比,Notch信号途径在胃癌恶性生物学行为中的作用及其机制的相关研究报道较少。在本实验中,我们首先利用实时荧光定量PCR.Western blotting及免疫荧光技术研究D114/NOtch信号通路相关基因及蛋白在胃癌细胞系表达情况,并利用免疫组化方法检测30例临床胃癌标本中D114蛋白表达情况及其分布,发现D114及Notch1胞内段NICD在5株胃癌细胞系中均有阳性表达,D114蛋白在胃癌组织中的表达阳性率明显高于癌旁及正常胃粘膜组织；随后,进一步在体外培养胃癌细胞系中研究了D114/Notch异常激活对胃癌增殖、侵袭、迁移及化疗药物敏感性等生物学行为的影响,并在荷瘤BALB/c雄性小鼠体内研究了D114/Notch异常激活对胃癌生长的影响。另外,我们初步研究了γ-分泌酶抑制剂DAPT对体外培养的胃癌细胞增殖的影响。2实验方法2.1D114及其主要受体Notch1在胃癌细胞系中的表达：利用Real-Time PCR. Western blotting与免疫荧光在mRNA与蛋白水平检测D114及Notch1受体活性胞内段NICD在胃癌细胞系中的表达水平。2.2D114在临床胃癌标本中的表达及其分布：利用免疫组化方法检测D114在30例临床胃癌组织、癌旁及正常胃粘膜组织中的表达及分布。2.3构建pEGFP-C1-D114过表达载体并建立过表达D114稳转胃癌细胞系：为研究D114/Notch过表达对胃癌增殖、迁移、侵袭、化疗敏感性等生物学行为的影响,构建pEGFP-C1-D114真核过表达载体,通过脂质体转染及G418筛选,建立D114过表达胃癌细胞系。2.4过度激活D114/Notch信号途径对胃癌细胞系增殖、化疗敏感性的影响：利用MTS检测D114/Notch过度激活对胃癌细胞系增殖、化疗敏感性的影响；并通过Real-Time PCR、Western blotting研究参与D114/Notch信号途径影响胃癌细胞系增殖、耐药的相关机制。2.5过度激活D114/Notch信号途径对胃癌细胞系侵袭、迁移的影响：利用Transwell检测过度激活D114/Notch信号途径对胃癌细胞系侵袭、迁移能力的影响；并通过Real-time PCR、Western blotting与明胶酶谱研究D114/Notch信号途径过度激活对胃癌侵袭相关分子的影响。2.6体内研究D114/Notch信号途径过度激活对胃癌生长的影响：将稳定转染pEGFP-C1-D114或空载体的胃癌细胞系注射于裸鼠皮下成瘤,通过测量瘤体大小计算肿瘤体积,研究过度激活D114/Notch信号途径对胃癌体内生长的影响,并初步探讨其机制。2.7体外研究γ-分泌酶抑制剂DAPT对胃癌细胞增殖的影响：利用不同浓度的Y-分泌酶抑制剂DAPT处理胃癌细胞,Western blotting检测Notch1受体活性胞内段NICD抑制效果,MTS检测细胞增殖率改变,Real-Time检测Notch信号通路相关基因表达。3实验结果3.1Real-Time PCR结果显示D114. Notch1及Y-分泌酶亚单位APH1基因在胃癌细胞系中均呈阳性表达；Western blotting显示D114蛋白在胃癌细胞系中呈不同强度的阳性表达；免疫组化检测显示Notch1受体活性胞内段NICD广泛分布于人胃癌细胞系及GES-1、HUVEC内；D114在胃癌组织中阳性表达率为86.67%,明显高于癌旁组织(30.00%)和正常胃粘膜组织(13.33%)。3.2成功构建真核重组质粒pEGFP-C1-D114,并建立过表达D114的稳转胃癌细胞系SGC-7901(过表达组SGC-DLL4)和空白质粒pEGFP-C1稳转SGC-7901细胞系(对照组SGC-Vector)。3.3MTS法检测显示过表达D114促进胃癌细胞SGC-7901增殖,transwell证实过表达D114增强其侵袭和迁移能力；Real-Time PCR显示过表达组SGC-DLL4基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9mRNA水平明显高于对照组SGC-Vector;明胶酶谱检测显示过表达组SGC-DLL4培养液中活性基质金属蛋白酶MMP-2显著高于对照组,而活性MMP-9蛋白水平低于对照组。3.4过表达D114对胃癌细胞SGC-7901化疗敏感性的影响：采用p-半乳糖苷酶染色法进行细胞衰老检测,结果显示分别经5-Fu(10uM),CDDP(10uM)及Heceptin(10uM)处理48h后,过表达组SGC-DLL4衰老细胞比例分别为19.35%、24.44%和23.81%,对照组SGC-Vector衰老细胞比例为60.78%,55.56%和61.82%,差异均具有非常显著的统计学意义。3.5过表达D114对胃癌细胞SGC-7901在裸鼠体内生长的影响：肿瘤细胞皮下注射1-2周,肉眼即可见到大小不等的皮下瘤。接种后第3,4,5,6周SGC-DLL4组瘤体大小分别为：519.19±125.30mm3,1108.48±538.75mm3,1853.06±777.11mm3和2640.51±923.61mm3,与对照组SGC-Vector组相比,差异具有统计学意义。对照组相比,过表达组SGC-DLL4肿瘤生长明显加快。3.6不同浓度梯度DAPT体外处理胃癌细胞系SGC-7901、MGC-803及胃粘膜细胞GES-124h、48h、72h后,MTS(?)去检测显示：经30uM DAPT处理48h、72h后,胃癌细胞SGC-7901增殖率分别为对照组(73.5±3.3)%和(73.8±3.4)%,具差异具有统计学意义；经40,50uM DAPT处理48h、72h后,胃癌细胞SGC-7901增殖率分别为对照组(57.5±3.4)%、(42.0±2.9)%和(45.5±4.1)%、(37.9±2.9)%,差异具有非常显著的统计学意义；而胃癌细胞MGC-803及胃粘膜膜细胞GES-1经上述浓度梯度的DAPT处理24h、48h、72h后,细胞增殖率与对照组均无显著性差异。3.7使用不同浓度DAPT体外处理胃癌细胞SGC-7901、MGC-80348h后,利用Western blotting检测Notch1胞内段NICD表达情况,结果显示经2.5、10、30uMDAPT处理48h后,胃癌细胞SGC-7901与MGC-803Notch1活性胞内片段NICD表达均较对照组明显减少。3.8使用不同浓度DAPT (10uM、30uM)体外处理胃癌细胞SGC-790148h后,利用Real-Time PCR检测Notch1及其下游基因Hes1、Hes6、Hey1和Hey2表达情况,结果显示经30uM DAPT处理48h,胃癌细胞SGC-7901中Hes1和Hey2mRNA水平为对照组的0.34±0.024倍和2.51±0.055倍,差异具有统计学意义。而经10uMDAPT处理48h后,上述基因mRNA水平与对照组无明显统计学差异。4研究结论4.1D114在胃癌组织中的表达阳性率显著高于癌旁及正常胃粘膜组织。4.2过表达D114促进胃癌细胞增殖、迁移,并通过提高细胞外活性基质金属蛋白酶MMP-2的浓度,增强胃癌细胞侵袭能力。4.3过表达D114降低胃癌细胞对常规化疗药物5-Fu、CDDP和Hercetin的敏感性,提示Dll4/Notch信号途径参与胃癌耐药形成机制。4.4过表达D114促进胃癌细胞SGC-7901在裸鼠体内生长。4.5通过DAPT(?)抑制Notch信号途径能降低部分胃癌的增殖能力,且作用效果具有浓度依赖性和时间依赖性。