论文部分内容阅读
高等植物中普遍存在着雄性不育现象,随着分子生物学的发展,有关雄性不育机理的研究取得了重大进展,研究表明线粒体与细胞质雄性不育有着十分密切的关系,线粒体基因组突变是导致雄性不育的重要原因,因此研究不育系与可育系线粒体基因的差异表达对揭示雄性不育的分子机理具有重要的意义。AFLP分子标记技术作为分析基因表达差异的一种主要方法,已被广泛应用于植物雄性不育基因表达特征分析与功能基因克隆,因而运用AFLP技术对雄性不育系枸杞花药线粒体差异基因的筛选是一种必要的途径。本研究旨在探索一套适合枸杞花药线粒体DNA的AFLP技术体系,为后续筛选不育系线粒体差异基因奠定必要的实验基础。本研究以枸杞花药为实验材料,分离提取花药线粒体及线粒体DNA,并以线粒体DNA为模板,建立了适合枸杞花药线粒体DNA-AFLP操作技术体系,具体得出以下结论：1.利用本实验改良后的差速离心方法分离出的枸杞花药线粒体,经过细胞学和分子生物学手段检测,表明纯度很高,线粒体具有很强活性,浓度和纯度高,结构完整并且得率较高,完全符合后续线粒体分子生物学相关研究需求。此实验方法既节省实验步骤,又节省时间,还减少破坏线粒体几率,因此可确定为适合枸杞花药线粒体分离方法。2.建立了一套适于枸杞花药线粒体DNA的AFLP技术体系。在建立适合枸杞花药线粒体DNA-AFLP体系时采用一步法和分步法均可以获得理想的酶切连接产物,但是前提是模板DNA的质量和浓度符合要求,一般模板DNA的OD260/280比值必须在1.8-1.9,同时OD260/230比值必须大于2.0。酶切连接反应的上样模板DNA的浓度一定不能低于100ng/ul,否则很难出现条带,在实验开始之前,一定要测模板DNA浓度,这是后续实验顺利进行的关键。选择性扩增操作中,酶切连接和预扩增符合要求,只要引物合适,就会得到预期理想结果。3.建立了适用于枸杞花药线粒体DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染技术。在聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中,预电泳的温度对实验结果影响比较大,预电泳温度达到45℃左右比较合适。正式电泳时的温度一直保持40-45℃,即可获得预期效果,否则条带发虚,甚至不出现条带。银染操作中,显影温度严格控制在9-10℃,可出现理想条带。