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龙须草(Eulaliopsis binata)为禾本科新发现的一种无融合生殖植物。本研究通过根尖细胞染色体制片技术,确定龙须草体细胞染色体数目。通过分析龙须草核型和观察花粉母细胞减数分裂过程中染色体行为与变异,判断其倍性水平和多倍体类型。以来自于中国5个省、12个居群的龙须草为材料,通过RAPD分子标记和形态学特征观察,分析12个龙须草居群间的遗传差异,划分出不同的类型。通过遗传差异较大的龙须草类型间杂交,利用RAPD分子标记,检测子代与亲本的差异,分析其无融合生殖程度,探明子代的生殖来源;并结合传粉生物学观察,研究龙须草无融合生殖的遗传学特性。
主要研究结果如下:
1) 对湖北丹江,湖南衡阳,河南内乡、西峡,陕西山阳5个居群的龙须草的根尖细胞染色体进行检测,每个居群观察30个以上根尖,每个根尖观察10-20分散良好的中期细胞,取其平均值作为根尖细胞染色体数目。五个居群共观察326个根尖,其中308个根尖细胞染色体为40条,占94.47%,因此龙须草体细胞染色体数目为40,即2n=40。观察中发现有18个根尖细胞染色体数目多于或少于40,有80、60、30和20等,还有一些根尖细胞具有非整倍染色体数,这些占观察根尖数的5.53%。这一结果表明:龙须草根尖细胞染色体存在一定的自然变异,种群中可能存在不同倍性的个体。所观察的几个龙须草居群的根尖细胞染色体数目未发现明显差异。
2) 龙须草核型分析结果显示:龙须草染色体形态较小,平均绝对长度为3.820±0.415 μ m,四个居群的龙须草在染色体形态特征上没有显著差异。龙须草40条染色体相对长度每两条相似,20对染色体,除了第6对和第11对为近中部着丝粒染色体外,其余18对都为中部着丝粒染色体,表现出较高的对称性,臂指数(N.F.)为80。最长的染色体与最短的染色体长度比为2.6356,大于2:1的比值,且没有臂比大于2:1的染色体,根据Stebbin(1971)的核型分类标准,龙须草的核型为1B型。用染色体分析软件计算出的核型参数,得出其核型公式为2n=40=18m+2sm。
3) 龙须草花粉母细胞减数分裂为连续型胞质分裂,终变期染色体构型为
20Ⅱ。在其减数分裂过程中观察到一些异常现象,前期Ⅰ出现不配对染色体,频率为34.3%;后期Ⅰ出现落后染色体,变幅为1-3个,频率为32.4%;末期Ⅱ-四分体时期可观察到明显的微核现象,频率为20%。 4)利用RAPD分子标记和形态特征观察,分析研究了中国12个龙须草居群的遗传差异,16个寡聚核苷酸引物扩增共得到124条带,其中110条为多态性带,占88.7%。Shannon多样性指数(I)为0.3590,物种水平Neis基因多样度(H)为0.2241。12个龙须草居群的遗传相似系数在0.48~0.99之间。12个居群的龙须草在植物体茎杆颜色、叶片颜色、生育期、茎高和花梗高度等形态特征上存在一定差异。聚类结果结合形态学特征分析, 12个龙须草居群可划分为4类,河南、湖北、陕西山阳的9个居群聚为1类,陕西洋县居群、广东星子山居群、广西百色居群各代表1类。
5)通过遗传差异较大的龙须草类型间杂交,获得杂交种子萌发后,得到46株F1代。利用RAPD分子标记,检测子代与亲本的差异,发现其中3株F1代与其母本带型不一致。龙须草传粉过程观察结果表明,其萌发的花粉管生长速度缓慢,而且生长有限,基本上没有能够到达子房进入胚珠的。分析认为龙须草无融合生殖程度较高,约93.5%。
本课题研究确定了龙须草为异源四倍体植物,具有40条染色体。把来自5个省的12龙须草居群划分成4种类型:类型Ⅰ为河南、湖北、陕西山阳等9个居群;类型Ⅱ为广东星子山居群;类型Ⅲ为陕西洋县居群;类型Ⅳ为广西百色居群。利用RAPD分子标记检测了龙须草46株杂交F1代,其中3株来自有性生殖方式,确定龙须草为兼性无融合生殖植物。